胚胎小鼠胃肠道神经元群体的免疫荧光染色

摘要

来源：Barlow-Anacker, A. J.，等，免疫染色法可视化小鼠肠神经系统发育。J. Vis. Exp. (2015)

本视频展示了利用免疫荧光和共聚焦显微镜技术对小鼠胚胎胃肠道进行免疫染色，以观察和分析神经元群体的分布情况。

方案

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 免疫染色实验方案

1. 若样品已保存在30%蔗糖中，则在摇床上用1×PBS冲洗3次，每次20分钟。
2. 将胃肠道组织置于封闭液中，在摇床上室温孵育1小时。
3. 移除封闭液，加入适量的一抗抗体（用封闭液稀释），在摇床上室温孵育4小时或4°C过夜。一抗包括：1:1,000稀释的人源抗-Hu抗体（来自患者血清）、1:1,000稀释的鸡源抗绿色荧光蛋白（GFP）抗体，以及1:100稀释的山羊源抗ChAT抗体。
   注意：我们使用的是从本地患者获取的人源抗-Hu抗体；但抗-Hu抗体也可商业购买，例如小鼠源抗-Hu抗体（使用1:500稀释）。
4. 在摇床上用1×PBS冲洗胃肠道组织3次，每次5分钟，随后再冲洗1小时，室温进行。
5. 更换为含二抗的溶液（用封闭液按1:500稀释），在摇床上室温孵育4小时或4°C过夜。使用以下二抗：胺反应性染料标记的驴抗人抗体（如Dylight）、驴抗鸡Cy2抗体和驴抗山羊Cy5抗体。若使用小鼠抗-Hu抗体，则使用1:500稀释的驴抗小鼠胺反应性染料405。
   注意：内源性GFP和tdTomato的表达强度以及免疫染色的清晰度随发育年龄增加而增强。我们通常将胚胎肠道单独置于0.2 ml离心管中，每管加入150 μl染色液，以减少抗体用量并确保组织染色充分。
6. 在摇床上用1×PBS冲洗胃肠道组织3次，每次5分钟，随后再冲洗1小时，室温进行。
7. 在载玻片上滴加数滴含DAPI的荧光封片剂。将胃肠道组织浸入封片剂中，直接在其上方加盖盖玻片。荧光封片剂-G是一种水溶性化合物，可提供半永久性密封。
   注意：可使用如Vectashield等基于甘油的荧光封片剂，可防止抗体荧光衰减和光漂白。这两种试剂均可使组织在4°C长期保存。
8. 使用共聚焦显微镜采集每种荧光染料的图像。激发波长和滤光片设置请参见表1。
9. 根据所用共聚焦显微镜的类型，使用相应的软件进行计算机辅助图像分析。

表1：  共聚焦成像的激发波长、荧光染料和滤光片。 列出了所使用的激发波长、可检测的荧光染料以及滤光片。该信息可用于选择多重免疫荧光实验中的二抗组合。

激发			发射
激光线	荧光团类型	示例	光电倍增管	筛选选项
408 nm	蓝色	Alexa Fluor 405、Cascade Blue、香豆素30、DAPI、Hoechst、Pacific Blue、大多数量子点	1	BP 425-475 nm
488 nm	绿色	Alexa Fluor 488、ATTO 488、钙黄绿素、Cy2、增强型绿色荧光蛋白（eGFP）、异硫氰酸荧光素（FITC）、俄勒冈绿、YO-PRO-1	2	BP 500-550 nm
561 nm	红色	Alexa Fluor 546、555、568 和 594，Cy3，DiI，DsRed，mCherry，藻红蛋白（PE），碘化丙啶（PI），RFP，TAMRA，tdTomato，TRITC	3	BP 570-620 nm
638 nm	远红	Alexa Fluor 633 和 647、别藻蓝蛋白（APC）、Cy5、TO-PRO-3	4	BP 663-738 nm

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
磷酸盐缓冲液	Oxoid	BR0014G
牛血清白蛋白	Fisher	BP1605
Triton X-100	Sigma	X100
荧光显微镜	Nikon	SMZ-18 体视显微镜
1.5 mL 离心管	VWR	20170-038
Fluoromount-G	SouthernBiotech, Birmingham, AL	0100-01
载玻片	Fisher	12-550-15
盖玻片	VWR	16004-330
共聚焦显微镜	Nikon	Nikon A1
Nikon Elements	Nikon