利用延时成像技术监测朊病毒样蛋白在转基因线虫中的跨细胞传播

摘要

来源：Nussbaum-Krammer, C. I.，等。利用多细胞模式生物 C. elegans 研究类朊病毒蛋白的扩散性与毒性。J. Vis. Exp. (2015)

本视频演示了对表达与红色荧光蛋白标记的类朊病毒蛋白的 C. elegans 进行活体成像的操作流程。该方案包括将线虫固定在琼脂糖垫上，进行延时共聚焦显微镜观察，以揭示蛋白质在细胞内及细胞间的聚集与运输过程。该技术对于研究与神经退行性疾病相关的蛋白质聚集具有重要意义。

方案

1. 通过监测跨细胞传播的朊病毒样蛋白 体内 延时成像

注意：根据标准方法培养野生型（WT）（N2）和转基因线虫 C. elegans，并严格控制培养温度。

1. 构建表达朊病毒样蛋白并标记有单体红色荧光蛋白（mRFP）的转基因 C. elegans 品系。
2. 通过产卵或次氯酸处理法，按照标准方法制备同步化群体。
   1. 通过产卵实现同步化
      1. 将10–20条成年雌雄同体线虫转移至培养板，使其产卵1–2小时。移除成年线虫后，让后代生长至所需年龄。
   2. 通过次氯酸处理实现同步化
      1. 收集未同步化的成年雌雄同体群体，用碱性次氯酸盐溶液（250 mM 氢氧化钠（NaOH）和商用漂白剂按1:4（v/v）比例溶于水（H₂O））进行裂解。用M9缓冲液（21 mM Na₂HPO₄·7H₂O（七水合二钠磷酸氢盐），22 mM KH₂PO₄（磷酸二氢钾），86 mM 氯化钠（NaCl），1 mM MgSO₄·7H₂O（七水合硫酸镁），加ddH₂O至1 L）洗涤卵两次（218 × g，每次1分钟）。
      2. 将卵置于M9缓冲液中，在20 °C下轻轻振荡过夜（O/N）使其孵化。在无食物条件下，线虫发育将停滞于L1阶段，从而获得同步化群体。将L1幼虫转移至接种了OP50 E. coli 细菌的新鲜线虫生长培养基（NGM）平板上，让其后代发育至所需年龄。
3. 按如下方法在载玻片上制备2%琼脂糖垫（以H₂O配制）。
   1. 取两张载玻片，在其整个长度上贴上标记胶带作为间隔物。将第三张载玻片置于二者之间。
   2. 将2%琼脂糖溶于H₂O中，吸取一滴置于洁净的载玻片上。
   3. 将第四张载玻片垂直放置于琼脂糖液滴上方，并轻轻下压，使琼脂糖垫厚度与标记胶带一致。
   4. 静置1分钟后，移除间隔物并轻轻将载玻片分开。琼脂糖垫将附着于其中一张载玻片上。
4. 在琼脂糖垫上加入约10 µL麻醉剂（含2 mM 左旋咪唑的M9缓冲液），用铂金丝挑取约10条线虫转移至垫上。加盖盖玻片（约22 × 22 mm），并在1小时内完成成像。
5. 或者，若需长时间拍摄动态影像或进一步减少动物移动的可能性，可采用麻醉剂联合微珠固定的方法。
   1. 按前述方法制备10%琼脂糖垫（以M9缓冲液配制），将线虫加入3 µL纳米微球尺寸标准溶液（聚苯乙烯微珠，100 nm）和3 µL麻醉剂（含4 mM 左旋咪唑的M9缓冲液）的混合液中。轻柔加盖盖玻片。为防止干燥，用VALAP（等量凡士林、羊毛脂和石蜡的混合物）封固盖玻片边缘。
6. 使用共聚焦显微镜对固定后的线虫进行成像。
   ​注意： 本实验采用配备EM-CCD相机的旋转盘AF共聚焦显微镜及显微成像自动化与图像分析软件（如MetaMorph）完成，具体参数设置如下，但其他性能相当的共聚焦成像系统亦可使用。
   1. 使用63X或100X/1.4NA油镜，将含有线虫的载玻片放入显微镜载物台夹具中。
   2. 打开软件，调节激光功率和滤光片以适配mRFP成像。使用561 nm激光，功率设为10%，发射滤光片设为>600 nm。
   3. 打开“多维采集”功能。在“主”选项卡中，勾选“时间序列”和“运行日志”（硬件自动对焦：关闭）。
   4. 在“保存”选项卡中，选择或创建用于保存文件的目录文件夹，并为文件命名。
   5. 在“波长”选项卡中，选择合适的照明模式并调节曝光时间和增益。使用“YokoQuad Red”（或适用于mRFP成像的等效照明设置），曝光时间设定在100–300毫秒之间，相机增益设定在100–300之间，具体数值根据样品实际情况（通过实时图像评估）调整。
   6. 在“时间序列”选项卡中，设定“时间点数量”= 301，“总时长”= 5分钟，“时间间隔”= 1秒。
   7. 在“日志”选项卡中，选择日志：“AFC SET Z HOLD”和“AFC Return to Z HOLD”，类型：“Special”（两次），初始点：“时间点开始”和“时间点结束”。该自动对焦选项对于在较长时间内持续成像同一焦平面至关重要。
   8. 设置完成后，点击“采集”。时间序列视频将以独立的TIFF文件格式保存。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
纳米球尺寸标准 100 nm	赛默飞世尔科技	3100A
左旋咪唑	Sigma	L-9756
仪器设备
Sorvall Legend XTR 冷冻离心机，120 VAC	赛默飞世尔科技	75004521	http://www.coleparmer.com/Product/Thermo_Scientific_Sorvall_Legend_ XTR_制冷离心机_120 VAC/EW-17707-60
96针复制器	Scionomix		http://www.scinomix.com/all-products/96-pin-replicator/
HiGro 高容量恒温振荡器	Digilab		http://www.digilabglobal.com/higro
Multidrop Combi 试剂分配仪	Titertrek		http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/titertek.htm
Biomek FX AP96 自动化工作站	贝克曼库尔特		http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/biomek_multi.htm
Innova44 摇床	新不伦瑞克		http://www.eppendorf.com/int///index.php?sitemap=2.3&pb=d78efbc05310ec 04&action=products&contentid=1& catalognode=83389
M205 FA	Leica		http://www.leica-microsystems.com/de/produkte/stereomikroskope-makroskope/fluoreszenz/details/product/leica-m205-fa/
ORCA-R2 C10600-10B 数字化CCD相机	滨松		http://www.hamamatsu.com/jp/en/community/life_science_camera/product/search/C10600-10B/index.html
转盘共聚焦显微镜	Leica		http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/life-science-research/fluorescence-microscopes/details/product/leica-sd-af/
Falcon 4M60 相机	Teledyne Dalsa		http://www.teledynedalsa.com/imaging/products/cameras/area-scan/falcon/PT-41-04M60/
软件
MetaMorph 显微镜自动化 & 图像分析软件	Molecular Devices		http://www.moleculardevices.com/products/software/meta-imaging-series/metamorph.html
滨松 SimplePCI 图像分析软件	Meyer Instruments		http://meyerinst.com/imaging-software/hamamatsu/index.htm
ImageJ	美国国立卫生研究院		http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
ImageJ 的 wrMTrck 插件			http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html
秀丽隐杆线虫品系
N2（野生型）	秀丽隐杆线虫遗传学中心（Caenorhabditis Genetics Center, CGC）		http://www.cgc.cbs.umn.edu/strain.php?id=10570