向大鼠黑质注射病毒载体以建立神经退行性疾病模型

摘要

来源：Van der Perren, A. 等，通过立体定向注射重组腺相关病毒载体构建基于α-突触核蛋白的帕金森病大鼠模型。J. Vis. Exp. （2016）。

本视频演示了将病毒载体注射到大鼠黑质以建立帕金森病模型的过程。内容概述了大鼠的术前准备、病毒载体向黑质的微量注射步骤以及术后恢复程序。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 重组腺相关病毒（rAAV）的制备与纯化

注意： rAAV 载体的生产与纯化由 Leuven 病毒载体核心实验室（LVVC）完成。

1. 简而言之，使用25 kD线性聚乙烯亚胺（PEI）转染液（含150 nM NaCl）及DMEM培养基（含2%胎牛血清），以1:1:1的比例对低传代（<50代）、亚融合状态的贴壁HEK 293T细胞进行转染。在37 °C、5% CO₂条件下孵育24小时后，更换为新鲜的DMEM培养基（含2%胎牛血清）。
   注意：所用质粒包括AAV7血清型的包装质粒、携带在CMVie增强型突触素1启动子控制下编码人A53T突变型α-突触核蛋白（α-SYN）的AAV转移质粒，以及pAdvDeltaF6腺病毒辅助质粒。
2. 在瞬时转染后第5天收集培养上清，并采用切向流过滤法进行浓缩。
3. 利用碘克沙醇阶梯梯度离心法从浓缩后的上清中纯化重组AAV（rAAV）载体颗粒。
4. 采用实时定量PCR标准技术测定基因组拷贝数（GC）。本方案中，使用3.0 E11 GC/ml的载体滴度构建基于α-SYN的帕金森病（PD）大鼠模型....

结果

图1：在大鼠黑质（SN）内立体定位注射编码α-SYN的rAAV2/7病毒载体。（A、B、E）大鼠颅骨上的颅缝，用于确定两个参考点：前囟（Bregma）和后囟（Lambda）。（C）大鼠脑立体定位图谱，显示注射区域即黑质（SN）。（D）将一只Wistar大鼠固定于立体定位仪头部框架中，使用两个耳杆以及口腔和鼻杆进行固定。（F）装有病毒载体的30号针头已准确定位于黑质。（G）在注射位点钻一小孔，并将针头置入预定位置.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
8周龄雌性Wistar大鼠	一月		200-250 g
氯胺酮（Nimatek）	欧洲兽医动物健康	804132
美托咪定（Dormitor）	Orion-Pharma / 强生动物健康	1070-499
头皮和耳部局部麻醉：利多卡因 2% 凝胶	阿斯利康	0137-547
Terramycine	辉瑞	0132-472
布托啡诺（Vetergesic）	Ecuphar	2623-627
1%碘异丙醇	VWR	0484-0100
立体定向头架	斯托林
Hamilton 注射器（30 号针头 -20 毫米 -pst 2）	汉密尔顿/过滤服务	7803-07
阿替美唑（Antisedan）	Orion-Pharma/Elanco	1300-185
rAAV A53T α-SYN 载体	LVVC，鲁汶大学		https://gbiomed.kuleuven.be/chinese/research/50000715/laboratory-of-molecular-virology-and-gene-therapy/lvvc/
DMEM，Glutamax	Life Technologies	N° 31331-093
胎牛血清	Life Technologies	N° 10270-106
25 kD线性聚乙烯亚胺（PEI）	Polysciences
OptiPrep 密度梯度介质：碘克沙醇	Sigma	D1556-250ML
Optimen	Life Technologies	N° 51985-026
Paxinos 第1卷 Watson 立体定位图谱，第四版	爱思唯尔