向大鼠黑质注射病毒载体以建立神经退行性疾病模型

摘要

来源：Van der Perren, A. 等，通过立体定向注射重组腺相关病毒载体构建基于α-突触核蛋白的帕金森病大鼠模型。J. Vis. Exp. （2016）。

本视频演示了将病毒载体注射到大鼠黑质以建立帕金森病模型的过程。内容概述了大鼠的术前准备、病毒载体向黑质的微量注射步骤以及术后恢复程序。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 重组腺相关病毒（rAAV）的制备与纯化

注意： rAAV 载体的生产与纯化由 Leuven 病毒载体核心实验室（LVVC）完成。

1. 简而言之，使用25 kD线性聚乙烯亚胺（PEI）转染液（含150 nM NaCl）及DMEM培养基（含2%胎牛血清），以1:1:1的比例对低传代（<50代）、亚融合状态的贴壁HEK 293T细胞进行转染。在37 °C、5% CO₂条件下孵育24小时后，更换为新鲜的DMEM培养基（含2%胎牛血清）。
   注意：所用质粒包括AAV7血清型的包装质粒、携带在CMVie增强型突触素1启动子控制下编码人A53T突变型α-突触核蛋白（α-SYN）的AAV转移质粒，以及pAdvDeltaF6腺病毒辅助质粒。
2. 在瞬时转染后第5天收集培养上清，并采用切向流过滤法进行浓缩。
3. 利用碘克沙醇阶梯梯度离心法从浓缩后的上清中纯化重组AAV（rAAV）载体颗粒。
4. 采用实时定量PCR标准技术测定基因组拷贝数（GC）。本方案中，使用3.0 E11 GC/ml的载体滴度构建基于α-SYN的帕金森病（PD）大鼠模型。

2. 在大鼠黑质（SN）中立体定位注射 rAAV α-SYN 载体（图 1）

1. 将约200–250 g重的八周龄雌性Wistar大鼠饲养在12小时光照/12小时黑暗的正常光周期条件下，自由摄取颗粒饲料和自来水。
2. 对大鼠进行腹腔注射（i.p.）麻醉，麻醉剂为氯胺酮（60 mg/kg）和美托咪啶（0.4 mg/kg）的混合液。待大鼠麻醉成功且挤压各足爪均无反应后，使用微型应答器植入器将微型应答器皮下植入大鼠背部，以便后续识别。检查微型应答器是否定位正确，并能被读取设备正常读取。
3. 剪除头皮顶部的毛发，在头皮和耳朵部位涂抹局部麻醉剂。其余手术操作均在层流罩下采用无菌技术进行。
4. 使用两个耳杆、一个口部固定器和一个鼻部固定器将大鼠固定于立体定位仪中。用纸毯覆盖大鼠身体，防止体温下降。涂抹眼用润滑剂，防止角膜干燥。
5. 用含1%碘伏的70%异丙醇对头皮进行消毒，并沿中线做一小切口。轻轻刮除颅骨表面的膜状组织，用生理盐水冲洗，然后让颅骨干燥数分钟。观察颅骨缝线及两个解剖参考点：前囟（Bregma）和后囟（Lambda）。
6. 为将rAAV载体注射至黑质（SN），需以前囟为参考点确定立体定位坐标（前后向：5.3 mm；内外向：2.0 mm；背腹向：7.2 mm，从硬脑膜起计算）。
   注意： 可通过大鼠脑立体定位图谱，以前囟为解剖参考点，计算出各目标区域的三维坐标。
7. 用rAAV载体填充10 µl微量注射器（30号针头，20 mm长），并将注射器安装至连接电动微量注射泵的立体定位装置上。通过释放一滴载体液体来校准注射体积，并用pH 9的多效清洗剂（例如 RBS）进行清洁处理。
8. 目视检查大鼠头部是否在头架中保持正直，并评估左右轴线对称性。仔细目测前囟和后囟的前后向与内外向坐标，并使用立体定位仪背腹向臂上的30号针头（20 mm）测量其高度。
   1. 前囟与后囟之间的高度差不得超过0.3 mm。将针头重新置于前囟位置，并通过调节立体定位仪的前后向和内外向臂来设定目标坐标。
9. 在注射位点测量颅骨高度，确保其与前囟高度相差不超过0.3 mm。用直径约2 mm的钻头在颅骨上钻孔。测量硬脑膜的高度，作为设定背腹向坐标的参考值；也可采用固定的颅骨厚度值（0.9 mm）进行减法校正。
10. 使用26号针头穿破硬脑膜，并用无菌纱布吸除血液。待出血完全停止后再继续操作。
11. 将预先装好载体溶液的10 µl微量注射器缓慢插入脑组织至预定深度（背腹向坐标）。针头留置1分钟，随后使用电动微量注射泵以0.25 µl/min的速度注入3 µl载体溶液（rAAV2/7 α-SYN 或 eGFP对照载体，中等剂量为3.0 E11基因组拷贝/ml，高剂量为1.0 E12 GC/ml）。
12. 注射完成后，将针头留置5分钟后再缓慢拔出。使用涂层编织聚酯缝线（3.0）缝合头皮，用含1%碘伏的70%异丙醇消毒，然后小心将动物从立体定位仪中取出。先松开鼻部和口部固定器，再松开两个耳杆。
13. 为逆转麻醉作用，向大鼠腹腔注射0.5 mg/kg阿替美唑，然后将大鼠置于清洁笼盒中，并放置于38 °C加热板上直至苏醒。用纸毯覆盖大鼠以防止体温下降。
14. 术后最初几小时内应确保食物和水易于获取。在术后最初几天内密切观察大鼠状态，必要时给予镇痛处理。
    注意： 无需拆除头皮缝线。1–2周后颅骨完全愈合，缝线会自行脱落。

结果

图1：在大鼠黑质（SN）内立体定位注射编码α-SYN的rAAV2/7病毒载体。（A、B、E）大鼠颅骨上的颅缝，用于确定两个参考点：前囟（Bregma）和后囟（Lambda）。（C）大鼠脑立体定位图谱，显示注射区域即黑质（SN）。（D）将一只Wistar大鼠固定于立体定位仪头部框架中，使用两个耳杆以及口腔和鼻杆进行固定。（F）装有病毒载体的30号针头已准确定位于黑质。（G）在注射位点钻一小孔，并将针头置入预定位置...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
8周龄雌性Wistar大鼠	一月		200-250 g
氯胺酮（Nimatek）	欧洲兽医动物健康	804132
美托咪定（Dormitor）	Orion-Pharma / 强生动物健康	1070-499
头皮和耳部局部麻醉：利多卡因 2% 凝胶	阿斯利康	0137-547
Terramycine	辉瑞	0132-472
布托啡诺（Vetergesic）	Ecuphar	2623-627
1%碘异丙醇	VWR	0484-0100
立体定向头架	斯托林
Hamilton 注射器（30 号针头 -20 毫米 -pst 2）	汉密尔顿/过滤服务	7803-07
阿替美唑（Antisedan）	Orion-Pharma/Elanco	1300-185
rAAV A53T α-SYN 载体	LVVC，鲁汶大学		https://gbiomed.kuleuven.be/chinese/research/50000715/laboratory-of-molecular-virology-and-gene-therapy/lvvc/
DMEM，Glutamax	Life Technologies	N° 31331-093
胎牛血清	Life Technologies	N° 10270-106
25 kD线性聚乙烯亚胺（PEI）	Polysciences
OptiPrep 密度梯度介质：碘克沙醇	Sigma	D1556-250ML
Optimen	Life Technologies	N° 51985-026
Paxinos 第1卷 Watson 立体定位图谱，第四版	爱思唯尔