从人死后脑组织中分离去污剂不溶性蛋白聚集体

摘要

来源：Diner, I.，等。从人类死后脑组织中富集去污剂不溶性蛋白质聚集体。J. Vis. Exp. (2017)。

本视频介绍了从冷冻的死后人脑组织中分离和富集去垢剂不溶性蛋白聚集体的过程。视频展示了关键步骤，包括匀浆、去垢剂处理、超声处理和超速离心，以分离和纯化不溶性聚集体。最后一步是将聚集体溶解于尿素缓冲液中，以便进一步分析。

方案

所有涉及样本采集的程序均按照本机构的IRB指南进行。

1. 匀浆与分级分离

1. 组织选择
   注意：选取健康对照（Ctl）和经病理确诊的阿尔茨海默病（AD）病例的冷冻死后额叶皮层组织（n=2）。根据阿尔茨海默病注册联盟（Consortium to Establish a Registry for Alzheimer's Disease）半定量评分标准对淀粉样斑块分布进行死后神经病理学评估，而神经原纤维缠结病变则依据 Braak 分期系统进行评估。
   1. 获取健康对照（Ctl）和经病理确诊的 AD 病例的冷冻死后脑组织。使用干冰容器、镊子和剃刀刀片，在已去皮的 disposable 称量舟中从每个组织样本中切取约 250 mg 的灰质部分，注意防止组织解冻。记录每块待均质化组织的重量。
   2. 使用镊子和剃刀通过肉眼观察定位外层灰质与内层白质的交界处，切取约 250 mg 的灰质。避免白质，更重要的是避开大血管、出血区域、软脑膜或蛛网膜。在切割过程中通过快速操作并将盛有脑组织的称量舟频繁放入装有干冰的聚苯乙烯容器中，保持组织处于冷冻状态。
   3. 使用分析天平记录从每块冷冻组织中切取的灰质的确切重量。计算用于 Dounce 均质化的低盐（LS）缓冲液的体积（见表 1）（5 mL/g 或 20% w/v）。
   4. 配制 10 mL 含 1× 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合液的低盐（LS）缓冲液，并置于冰上预冷。
   5. 将称重后的组织及称量舟从干冰中取出，在组织解冻时将其切成约 2 × 2 mm 的小块。转移至预冷的 2 mL Dounce 均质化管中，置于冰上。
   6. 加入 5 mL/g（20% w/v）的冰冻低盐（LS）缓冲液，含 1× 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合液。
   7. 在冰上使用高间隙研杵 A 约 10 次，低间隙研杵 B 约 15 次，对脑组织进行均质化。
   8. 使用玻璃巴斯德移液管将全部均质液转移至 2 mL 聚丙烯管中。在管上标记“TH”（总均质液）、组织病例编号及均质液体积。  取 0.8 mL 分装至已标记的 1.5 mL 管中。多余的均质液可同样分装并储存于 -80 °C。
   9. 向每个 0.8 mL 分装样品中分别加入 100 µL 的 5 M NaCl 和 10%（w/v）Sarkosyl，使其终浓度分别为 0.5 M 和 1% w/v。通过倒置充分混匀各管，并在冰上孵育 15 分钟。在管上标记“TH-S”（总均质液-Sarkosyl），表示均质液处于 Sarkosyl 缓冲液中（表 1）。
   10. 使用微头探针在冰上以 30% 振幅（最大强度 = 40%）对每管进行三次、每次 5 秒的超声处理。
   11. 使用二辛可宁酸（BCA）法测定均质液的蛋白浓度。
       注意：以每克组织 5 mL LS 缓冲液制备的 TH-S 均质液，其平均蛋白浓度为 15–20 mg/mL。均质液可立即进行分级分离，或储存于 -80 °C 待用。
   12. 使用含 1× 蛋白酶和磷酸酶抑制剂的冰冻 Sark 缓冲液（表 1）将 TH-S 均质液稀释至 10 mg/mL。
   13. 将每份 TH-S 均质液中的 5 mg 蛋白（0.5 mL）转移至 500 µL 聚碳酸酯超速离心管中，并用 Sark 缓冲液配平。将管子装入预冷的转子中，在 4 °C 下以 180,000 × g 离心 30 分钟。将 Sarkosyl 可溶性上清液（S1）转移至 1.5 mL 管中，并储存于 -80 °C。
       注意：（可选洗涤步骤）向含有去污剂不溶性组分（P1）的超速离心管中加入 200 µL Sark 缓冲液，并使用 200 µL 移液枪头将沉淀（P1）从管底刮下。
   14. 将倒置的管在微量离心机上短暂脉冲离心 2–3 秒（≤2,500 x g），使沉淀（P1）和缓冲液转移至下方的 1.5 mL 管中。通过反复吹打使不溶性沉淀（P1）在 Sark 缓冲液中重悬，确保沉淀完全分散。
   15. 配平后，在 4 °C 下以 180,000 × g 再次离心 30 分钟。
   16. 弃去可选的洗涤上清液（S2），将 Sarkosyl 不溶性沉淀（P2）在含 1× PIC（蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合液）的 50–75 µL 尿素缓冲液（表 1）中于室温孵育 30 分钟，以溶解沉淀。
       注意：使用前将尿素缓冲液升温至室温，以避免 SDS 沉淀。对于对去污剂敏感的应用，可从尿素缓冲液中省略 SDS，并考虑在用尿素缓冲液重悬前，先用低盐缓冲液洗涤不溶性沉淀（P2）。
   17. 将重悬的沉淀（P2）转移至 0.5 mL 管中，使用微头探针在 20% 振幅（最大强度 = 40%）下进行短暂（1 秒）超声处理，以完全溶解沉淀。
   18. 使用 BCA 法测定 Sarkosyl 可溶性（S1）和不溶性（P2）组分的蛋白浓度。可立即使用这些组分，或储存于 -80 °C 待用。

表1：缓冲液列表

10% w/v 月桂酰肌氨酸钠溶液：每 100 ml 去离子水（ddH2O）中加入 10 g N-月桂酰肌氨酸钠盐（室温下搅拌过夜）

低盐（LS）缓冲液：50 mM HEPES（pH 7.0），250 mM 蔗糖，1 mM EDTA

月桂酰肌氨酸钠（sark）缓冲液：LS 缓冲液 + 1% (w/v) 月桂酰肌氨酸钠 + 0.5 M NaCl

尿素缓冲液（于 -20 °C 保存）：50 mM Tris-HCl（pH 8.5），8 M 尿素，2% SDS

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物（无EDTA，100倍浓缩液）	Thermo Fisher	78441	蛋白酶 & 磷酸酶抑制剂混合物
Sonic Dismembrator 系统（超声破碎仪）	Fisher Scientific	FB505110	微尖超声破碎仪
Optimax TLX 超速离心机	Beckman Coulter	361545	制冷型超速离心机
TLA120.1 转子	Beckman Coulter	362224	超速离心机转子
500 µl（8x34 mm）聚碳酸酯厚壁管	Beckman Coulter	362224	适用于 TLA120.1 转子的超速离心管
N-月桂酰肌氨酸钠盐（sarkosyl）	Sigma Aldrich	L5777-50G	去垢剂
1.5 ml 聚丙烯研磨杵（Pellet Pestle）	Kimble Chase	749521-1500	匀浆工具
Pellet Pestle 用无线电机	Kimble Chase	749540-0000	匀浆工具