在实验性自身免疫性神经炎小鼠模型中评估运动功能

摘要

来源:Gonsalvez， D. G.， et al.， 一种在 C57BL/6 小鼠中诱导实验性自身免疫性神经炎的简单方法，用于功能和神经病理学评估。J. Vis. Exp. （2017 年）。

该视频演示了通过施用百日咳毒素和含有髓鞘模拟肽和佐剂的接种物来评估小鼠模型中运动功能障碍的过程，然后进行跑步机测试以评估运动功能并评估由于免疫激活和脱髓鞘而产生的神经损伤。

方案

所有涉及动物模型的程序均已由当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审查。

1. EAN（实验性自身免疫性神经炎）诱导

注意:可以在 6-8 周龄的雄性 C57BL/6 小鼠中成功诱导 EAN。诱导方案总共需要 9 天。第 0 天是指第一次免疫接种的日期。对于该方案，注射在麻醉下进行（参见下面的步骤 1.1.2）。

1. 第 -1 天:
   1. 使用无菌 0.1 M 小鼠等渗磷酸盐缓冲盐水 （MT-PBS） 制备 1.6 μg/mL 的百日咳毒素（参见材料表）溶液。
   2. 异氟醚麻醉:
      1. 将小鼠（C57BL/6，雄性，6-8 周）放入麻醉室中，并将氧气流量调节至 1 L/min。
      2. 打开异氟醚蒸发器，将其调节至 2.5% 进行麻醉，监测呼吸，等待 2 分钟或直到原发性反射（角膜和后肢）不再反应。
   3. 将小鼠从麻醉室中取出，并使用带有 30_1/2 G 针头的 0.5 mL 注射器通过腹膜内 （ip.） 注射 250 μL 上述百日咳毒素溶液。
   4. 准备用于免疫的注射接种物:
      1. 使用 2 mg/mL 的 P0180-199 肽溶液（纯度> 98%，序列 S-S-K-R-G-R-Q-T-P-V-L-Y-A-M-L-D-H-S-R-S）在 0.9% 盐水中制备溶液 A。
      2. 使用 20 mg/mL 结核分枝杆菌溶液（参见材料表）在弗洛伊德完全佐剂（FCA，包括 15% 甘露化物单硼酸盐 + 85% 石蜡油和 0.5 mg/mL 干燥的灭活和干燥的丁酸分枝杆菌）中制备溶液 B。
      3. 为了制备用于注射的最终接种物，将等体积的溶液 A 和 B 混合在珠子打浆器中，并在室温下以最大速度混合 1 分钟><。 注意: 溶液 A 和 B 可以作为库存保存并在 4 °C 下储存最多一个月，但组合的最终接种物必须在小鼠注射当天新鲜制备。
2. 在第 0 天，使用 23 G 针头通过皮下注射将 50 μL 接种物（步骤 1.1.4 中概述的制备）注入小鼠><中。 注意:注射可以放置在肩胛骨之间或尾侧背上的后肢和尾部之间。
3. 第 1 天，制备 1.2 μg/mL（在 MT-PBS 中）的百日咳毒素溶液，并使用带有 301/2 G 针头的 0.5 mL 注射器通过腹腔注射将 250 μL 注入小鼠中。
4. 在第 3 天，重复上述步骤 1.3。
   注意:储备溶液 A 和 B 可以配制并在 4 °C 下储存最多一个月。然而，通过混合储备溶液 A 和 B 产生的最终可注射接种物必须在注射当天完成。
5. 第 8 天，通过与步骤 1.2 相同的注射部位（对于每只动物），通过皮下注射（参见上面的步骤 1.2）将 50 μL 接种物（步骤1.1.4中概述的制备）注入小鼠中

2. 运动功能评估

注意:运动性能与同一组动物的临床评分同时进行评估。运动功能评估设备必须连接到安装了步态功能成像系统（见材料表）的计算机。还建议所有要评估的小鼠在 EAN 诱导之前都应习惯于跑步任务。为此，在疾病诱导前三天（第 -3 天）进行练习运行（每只小鼠 2 次测试运行）。

1. 打开运动功能评估仪并打开灯光按钮。
2. 用力捏住老鼠，并握住它的尾巴，将鼠标放到装满红色墨水的容器上，为它的脚上墨><迹。 注意: 此步骤对于 C57BL/6 菌株是必需的，但如果使用的是白色外套颜色的小鼠菌株，则可以跳过此步骤。
3. 将鼠标放入步行隔间，并将跑步机速度设置为 15 cm/s。
4. 打开跑步机并单击 "录制" 按钮，使用步态功能成像系统捕捉鼠标的跑步动作（参见材料表）。
5. 使用计时器并测量每个运行的 36 秒。36 秒后，停止录制并停止跑步机。
   注意: 如果 mice 在 36 s 间隔内无法成功完成运行任务，则视为失败。
6. 将视频文件保存在指定的文件夹中。
7. 对每只要评估的小鼠重复上述步骤。每 3 天测试一次具有相同运行任务的小鼠。
8. 使用软件分析编辑后的视频文件以获取步态功能参数（参见材料表）.
   注意:如何分析不同电机参数的详细信息因软件而异，因此在分析之前请参考制造商的说明。根据研究的具体目标，可以在运动后功能评估的任何阶段采集动物组织，以通过免疫组织化学或电子显微镜获得轴突和髓鞘损伤的组织学证据。

结果

表 1:EAN 临床评分范式。

<表格border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> 得分 标准 关于评估标准的注释和评论 0 普通鼠标 1 不太活泼的 OR 泡沫 这是根据正常处理进行评估的，小鼠通常在免疫后第 5 天首次表现出活动减少的迹象 2 尾部麻痹 OR <...

材料