Assessing Motor Function in an Experimental Autoimmune Neuritis Mouse Model

doi:10.3791/31369

Abstract

来源:Gonsalvez， D. G.， et al.， 一种在 C57BL/6 小鼠中诱导实验性自身免疫性神经炎的简单方法，用于功能和神经病理学评估。J. Vis. Exp. （2017 年）。

该视频演示了通过施用百日咳毒素和含有髓鞘模拟肽和佐剂的接种物来评估小鼠模型中运动功能障碍的过程，然后进行跑步机测试以评估运动功能并评估由于免疫激活和脱髓鞘而产生的神经损伤。

Protocol

所有涉及动物模型的程序均已由当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审查。

1. EAN（实验性自身免疫性神经炎）诱导

注意:可以在 6-8 周龄的雄性 C57BL/6 小鼠中成功诱导 EAN。诱导方案总共需要 9 天。第 0 天是指第一次免疫接种的日期。对于该方案，注射在麻醉下进行（参见下面的步骤 1.1.2）。

第 -1 天:
1. 使用无菌 0.1 M 小鼠等渗磷酸盐缓冲盐水（MT-PBS）制备 1.6 μg/mL 的百日咳毒素（参见材料表）溶液。
2. 异氟醚麻醉:
  1. 将小鼠（C57BL/6，雄性，6-8 周）放入麻醉室中，并将氧气流量调节至 1 L/min。
  2. 打开异氟醚蒸发器，将其调节至 2.5% 进行麻醉，监测呼吸，等待 2 分钟或直到原发性反射（角膜和后肢）不再反应。
3. 将小鼠从麻醉室中取出，并使用带有 30_1/2 G 针头的 0.5 mL 注射器通过腹膜内（ip.）注射 250 μL 上述百日咳毒素溶液。
4. 准备用于免疫的注射接种物:
  1. 使用 2 mg/mL 的 P0180-199 肽溶液（纯度> 98%，序列 S-S-K-R-G-R-Q-T-P-V-L-Y-A-M-L-D-H-S-R-S）在 0.9% 盐水中制备溶液 A。
  2. 使用 20 mg/mL 结核分枝杆菌溶液（参见材料表）在弗洛伊德完全佐剂（FCA，包括 15% 甘露化物单硼酸盐 + 85% 石蜡油和 0.5 mg/mL 干燥的灭活和干燥的丁酸分枝杆菌）中制备溶液 B。
  3. 为了制备用于注射的最终接种物，将等体积的溶液 A 和 B 混合在珠子打浆器中，并在室温下以最大速度混合 1 分钟><。 注意: 溶液 A 和 B 可以作为库存保存并在 4 °C 下储存最多一个月，但组合的最终接种物必须在小鼠注射当天新鲜制备。
在第 0 天，使用 23 G 针头通过皮下注射将 50 μL 接种物（步骤 1.1.4 中概述的制备）注入小鼠><中。 注意:注射可以放置在肩胛骨之间或尾侧背上的后肢和尾部之间。
第 1 天，制备 1.2 μg/mL（在 MT-PBS 中）的百日咳毒素溶液，并使用带有 301/2 G 针头的 0.5 mL 注射器通过腹腔注射将 250 μL 注入小鼠中。
在第 3 天，重复上述步骤 1.3。
注意:储备溶液 A 和 B 可以配制并在 4 °C 下储存最多一个月。然而，通过混合储备溶液 A 和 B 产生的最终可注射接种物必须在注射当天完成。
第 8 天，通过与步骤 1.2 相同的注射部位（对于每只动物），通过皮下注射（参见上面的步骤 1.2）将 50 μL 接种物（步骤1.1.4中概述的制备）注入小鼠中

2. 运动功能评估

注意:运动性能与同一组动物的临床评分同时进行评估。运动功能评估设备必须连接到安装了步态功能成像系统（见材料表）的计算机。还建议所有要评估的小鼠在 EAN 诱导之前都应习惯于跑步任务。为此，在疾病诱导前三天（第 -3 天）进行练习运行（每只小鼠 2 次测试运行）。

打开运动功能评估仪并打开灯光按钮。
用力捏住老鼠，并握住它的尾巴，将鼠标放到装满红色墨水的容器上，为它的脚上墨><迹。 注意: 此步骤对于 C57BL/6 菌株是必需的，但如果使用的是白色外套颜色的小鼠菌株，则可以跳过此步骤。
将鼠标放入步行隔间，并将跑步机速度设置为 15 cm/s。
打开跑步机并单击 "录制" 按钮，使用步态功能成像系统捕捉鼠标的跑步动作（参见材料表）。
使用计时器并测量每个运行的 36 秒。36 秒后，停止录制并停止跑步机。
注意: 如果 mice 在 36 s 间隔内无法成功完成运行任务，则视为失败。
将视频文件保存在指定的文件夹中。
对每只要评估的小鼠重复上述步骤。每 3 天测试一次具有相同运行任务的小鼠。
使用软件分析编辑后的视频文件以获取步态功能参数（参见材料表）.
注意:如何分析不同电机参数的详细信息因软件而异，因此在分析之前请参考制造商的说明。根据研究的具体目标，可以在运动后功能评估的任何阶段采集动物组织，以通过免疫组织化学或电子显微镜获得轴突和髓鞘损伤的组织学证据。

Representative Results

表 1:EAN 临床评分范式。

得分标准 关于评估标准的注释和评论 0 普通鼠标 1 不太活泼的 OR 泡沫这是根据正常处理进行评估的，小鼠通常在免疫后第 5 天首次表现出活动减少的迹象 2 尾部麻痹 OR 尾部麻痹通过尾部卒中试验（甩尾巴）进行评估。轻度肢体麻痹轻度肢体麻瘫是指老鼠在平坦的表面上行走时，将腹部拖在地面上 3 尾部麻痹 + 轻度肢体麻痹或轻度共济失调被评估为正常行走的任何困难尾部麻痹 + 轻度共济失调或轻度肢体麻痹 + 轻度共济失调 4 重度共济失调重度共济失调的识别表现为非典型向后行走，伴有肢体麻痹、轻度肢体麻痹或尾部麻痹

Disclosures

No conflicts of interest declared.

Materials

<表格border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> C57BL/6，雄性， 6-8 周龄澳大利亚生物资源中心（Australian Bioresources Cenre）， WA， Australia 百日咳毒素 List Biological Laboratories， Inc.， CA，美国 #181 0.1M 小鼠等渗磷酸盐缓冲盐水（MT-PBS）实验室将有自己的协议。异氟醚澳大利亚昆士兰州 Pharmachem 实验室将有自己的给药方案。 P0180–199 肽 Wuxi Nordisk Biotech Co. 中尉 SHG， CHN P0180–199，序列 S-S-K-R-G–R– Q-T–P-V-L–Y–A–M–L–D–H–S–R–S 热灭活结核分枝杆菌（菌株 H37RA）美国密歇根州迪夫科 #231141 弗氏完全佐剂（FCA）美国密歇根州迪夫科 #263910 16% 多聚甲醛（PFA）电子显微镜服务 #15710 稀释至 4% PFA 组织收集日。 25% 戊二醛 ProSciTech Pty Ltd， QLD，澳大利亚 #11-30-8 稀释至 2.5% 戊二醛固定日。叠氮化钠 Chem-Supply Pty Ltd， SA，澳大利亚 SL189型在 0.1M MT-PBS 中制备 10% （w/v）原液。用量为 0.03% （v/v）。蔗糖 Chem-Supply Pty Ltd， SA，澳大利亚 SA030 系列用量为 30% （w/v）。最佳切割温度（OCT）介质 Sakura Finetek，美国加利福尼亚州排名 #4583 正常驴血清美国马萨诸塞州默克米利波尔 #S30-100 用作 10% （v/v）或由自己实验室确定的其他浓度的抗体稀释剂。海卫一 X 100 Sigma Aldrich，美国密歇根州 #90o2-31-1 用于 0.3% （v/v）或由自己实验室确定的其他浓度的抗体稀释剂中。兔抗淀粉样蛋白前体蛋白（APP） Invitrogen （Life Technologies），美国加利福尼亚州 S12700 系列以 1:400 的比例使用或在自己的实验室中滴定。兔抗接触蛋白相关蛋白-1 （Caspr）由以色列 Wiezmann 科学研究所的 Elior Peles 教授捐赠以 1:500 的比例使用或在自己的实验室中滴定。适当的 Alexa Fluor 偶联二抗 Molecular Probes （Life Technologies），美国俄勒冈州各种以 1:200 的比例使用或在自己的实验室中滴定。抗体制备物种的选择以及 Alexa Fluor 的选择由每个实验室自行决定。水性封片液 Dako （Agilent）， CA，美国 #S3023 每个实验室都有自己的偏好。设备 0.5 mL 注射器，带 301/2 g 针头屋宇署 #326105 23 克针头屋宇署 #305143 红色印台任何红色的印台或红色的食用染料都可以用来标记动物的脚。 DigiGate 设备（包括跑步机） eMouse Specifics Inc. 马萨诸塞州弗雷明汉 DigiGate 成像系统 eMouse Specifics Inc. 马萨诸塞州弗雷明汉秒表可以使用任何计时器。 DigiGait 8 软件 eMouse Specifics Inc. 马萨诸塞州弗雷明汉解剖显微镜蔡司可以使用任何合适的解剖显微镜。带电幻灯片 Superfrost Plus，Lomb Scientific Pty Ltd SF41296SP Cyrostat 徕卡可以使用任何合适的 cyrostat。灌注设备和解剖仪器实验室将拥有自己的灌注 protoctol。不透明的浑身腔实验室可以使用不透明的塑料容器生产自己的实验室。 PAP pene GeneTex （美国）蜡笔或表面张力也可用于在组织切片周围创建一个孔。共聚焦显微镜蔡司 LSM780 可以使用任何具有适当激光线的共聚焦显微镜。斐济/Image J 美国国家卫生研究所 www.fiji.sc 起提供

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在实验性自身免疫性神经炎小鼠模型中评估运动功能