评估实验性自身免疫性神经炎小鼠模型中的运动功能

摘要

来源：Gonsalvez, D. G.，等，在C57BL/6小鼠中诱导实验性自身免疫性神经炎以进行功能与神经病理学评估的简易方法。J. Vis. Exp. (2017)。

本视频展示了通过注射百日咳毒素以及含有模拟髓鞘肽段和佐剂的接种物，在小鼠模型中评估运动功能障碍的过程，随后进行跑台实验以评估运动功能，并评价因免疫激活和脱髓鞘所导致的神经损伤。

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. EAN（实验性自身免疫性神经炎）诱导

注意：可在6至8周龄的雄性C57BL/6小鼠中成功诱导EAN。诱导方案总共需要9天。第0天指首次免疫当天。本方案中的注射操作均在麻醉下进行（见下文步骤1.1.2）。

1. 在第 -1 天：
   1. 制备百日咳毒素（参见 材料表使用无菌的0.1 M小鼠等渗磷酸盐缓冲液（MT-PBS）配制1.6 µg/mL的溶液。
   2. 异氟烷麻醉：
      1. 将小鼠（C57BL/6，雄性，6–8周龄）放入麻醉舱中，并调节氧气流速至1 L/min。
      2. 打开异氟烷挥发罐，调节至2.5%用于麻醉，监测呼吸，等待2分钟或直至主要反射（角膜反射和后肢反射）消失。
   3. 将小鼠从麻醉室中取出，使用带有30号针头的0.5 mL注射器，通过腹腔（i.p.）注射250 µL上述百日咳毒素溶液。_1/2 G针
   4. 制备用于免疫接种的可注射接种物：
      1. 使用2 mg/mL的P0180-199肽溶液（批号 > 98% 纯度，序列 S-S-K-R-G-R-Q-T-P-V-L-Y-A-M-L-D-H-S-R-S）溶于 0.9% 生理盐水中。
      2. 使用20 mg/mL的溶液制备溶液B 分枝杆菌属 结核病 （参见 材料表) 在弗氏完全佐剂（FCA，包含15%单油酸甘露醇酯 + 85%石蜡油以及0.5 mg/mL干燥灭活的结核分枝杆菌）中 Mycobacterium butyricum).
      3. 为制备最终接种液，将溶液A与溶液B等体积混合于振荡研磨仪中，在室温下以最大速度混合1分钟。
         注意： 溶液A和溶液B可作为储备液保存，在4 °C下最多保存一个月，但混合后的最终接种液必须在小鼠注射当天新鲜配制。
2. 在第0天，使用23 G针头通过皮下注射将50 µL接种物（步骤1.1.4中所述制备）注入小鼠体内。
   注意： 注射可置于肩胛骨之间，或后肢与尾部之间的尾背部区域。
3. 第1天，配制1.2 µg/mL（溶于MT-PBS）的百日咳毒素溶液，使用0.5 mL注射器配合301/2 G针头，通过腹腔注射方式向小鼠注入250 µL。
4. 第3天，重复上述步骤1.3。
   注意： 储备液A和B可配制后于4 ˚C保存，最多保存一个月。然而，将储备液A与B混合后所得的最终注射用接种物必须在注射当日配制。
5. 第8天，通过皮下注射方式，将50 µL接种物（按步骤1.1.4制备）注入小鼠，注射位点与步骤1.2中所述相同（每只动物均如此操作）。

2. 运动功能评估

注意：运动功能评估需与同一批动物的临床评分同时进行。运动功能评估装置必须连接至安装有步态功能成像系统的计算机（参见材料表）。建议在诱导EAN之前，使所有待测小鼠先适应跑步任务。为此，应在疾病诱导前3天（第-3天）进行练习运行（每只小鼠进行2次测试运行）。

1. 打开运动功能评估装置，并按下光源按钮。
2. 牢固地抓起小鼠的颈背部，同时握住其尾巴，将其足部浸入装有红色印泥的容器中进行染色。
   注意：此步骤适用于C57BL/6品系小鼠；若使用毛色为白色的品系小鼠，则可省略此步骤。
3. 将小鼠放入行走舱内，并将跑步机速度设定为15 cm/s。
4. 启动跑步机，并点击“记录”按钮，利用步态功能成像系统（见材料表）捕捉小鼠的跑步动作。
5. 使用计时器，每次跑步记录时长为36秒。36秒后，停止录制并关闭跑步机。
   注意：若小鼠无法在36秒内顺利完成跑步任务，则视为测试失败。
6. 将视频文件保存至指定文件夹中。
7. 对每只待评估的小鼠重复上述步骤。每3天使用相同的跑步任务对小鼠进行一次测试。
8. 使用步态功能参数分析软件对编辑后的视频文件进行分析（见材料表）。
   注意：不同软件对各项运动参数的分析方法有所不同，因此在分析前请参考制造商提供的操作说明。根据研究的具体目标，可在运动功能评估后的任意阶段取材动物组织，通过免疫组织化学或电子显微镜技术获取轴突和髓鞘损伤的组织学证据。

结果

表1：EAN临床评分范式。

评分	标准	评估标准的说明与备注
0	正常小鼠
1	活力降低或嗜睡	该评估基于常规操作下的反应；小鼠通常在免疫后第5天开始出现活动减少的迹象
2	尾部轻瘫 或	尾部轻瘫通...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
C57BL/6，雄性，6-8 周龄	Australian Bioresources Centre, WA, 澳大利亚
百日咳毒素	List Biological Laboratories, Inc., CA, 美国	#181
0.1M 小鼠等渗磷酸盐缓冲盐水 (MT-PBS)			各实验室将有其自身的操作方案。
异氟烷	Pharmachem, QLD, 澳大利亚		各实验室将有其自身的给药方案。
P0180–199 肽段	无锡诺迪斯科生物科技有限公司，中国		P0180–199，序列 S–S–K–R–G–R–Q–T–P–V–L–Y–A–M–L–D–H–S–R–S
热灭活结核分枝杆菌（H37RA 菌株）	Difco, MI, 美国	#231141
弗氏完全佐剂 (FCA)	Difco, MI, 美国	#263910
16% 多聚甲醛 (PFA)	Electron Microscopy Services	#15710	组织采集当日稀释为 4% PFA。
25% 戊二醛	ProSciTech Pty Ltd, QLD, 澳大利亚	#11-30-8	固定当日稀释为 2.5% 戊二醛。
叠氮化钠	Chem-Supply Pty Ltd, SA, 澳大利亚	SL189	在 0.1M MT-PBS 中配制 10% (w/v) 储存液，使用浓度为 0.03% (v/v)。
蔗糖	Chem-Supply Pty Ltd, SA, 澳大利亚	SA030	使用浓度为 30% (w/v)。
最佳切割温度 (OCT) 包埋介质	Sakura Finetek, CA, 美国	#4583
正常驴血清	Merck Millipore, MA, 美国	#S30-100	作为抗体稀释液使用，浓度为 10% (v/v)，或根据各实验室自行确定的其他浓度。
吐温-100 (Triton-X 100)	Sigma Aldrich, MI, 美国	#90o2-31-1	在抗体稀释液中使用浓度为 0.3% (v/v)，或根据各实验室自行确定的其他浓度。
兔抗淀粉样前体蛋白 (APP) 抗体	Invitrogen (Life Technologies), CA, 美国	S12700	使用稀释比例为 1:400，或在本实验室进行滴定优化。
兔抗接触蛋白相关蛋白-1 (Caspr) 抗体	由以色列魏茨曼科学研究所 Elior Peles 教授惠赠		使用稀释比例为 1:500，或在本实验室进行滴定优化。
相应的 Alexa Fluor 标记二抗	Molecular Probes (Life Technologies), OR, 美国	Various	使用稀释比例为 1:200，或在本实验室进行滴定优化。二抗宿主物种及 Alexa Fluor 染料的选择由各实验室自行决定。
水性封片液	Dako (Agilent), CA, 美国	#S3023	各实验室可根据偏好选择。
仪器设备
0.5 mL 注射器配 30½ 号针头	BD	#326105
23 号针头	BD	#305143
红色印台			可使用任意红色印台或红色食用染料标记动物足部。
DigiGate 装置（含跑步机）	eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
DigiGate 成像系统	eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
秒表			可使用任意计时器。
DigiGait 8 软件	eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
解剖显微镜	Zeiss		可使用任意合适的解剖显微镜。
带电载玻片	Superfrost Plus, Lomb Scientific Pty Ltd	SF41296SP
冷冻切片机	Leica		可使用任意合适的冷冻切片机。
灌流设备及解剖器械			各实验室将有其自身的灌流方案。
不透光加湿室			各实验室可使用不透明塑料容器自制。
PAP 笔	GeneTex (美国)		可使用蜡笔，或利用表面张力在组织切片周围形成液封区域。
共聚焦显微镜	Zeiss LSM780		可使用任意具备合适激光线的共聚焦显微镜。
FIJI/Image J	美国国立卫生研究院		可从 www.fiji.sc 获取