转基因果蝇大脑中蛋白质聚集体的成像和定量

Abstract

来源:Donnelly， KM 等人 监测黑腹果蝇中朊病毒样蛋白聚集体的细胞间传递。J. Vis. Exp.（2018 年）

该视频演示了转基因果蝇大脑中蛋白质聚集体的成像和定量。在镶嵌之前，将大脑固定、清洗并用抗褪色剂处理。使用共聚焦显微镜捕获图像并进行定量以观察突变蛋白聚集体的传递。

Protocol

1. 偶联 Gal4 和 QF 介导的果蝇 Htt 转基因表达

1. 收集和/或生成含有组织特异性 Gal4 或 QF"驱动因素"的转基因黑腹果蝇品系，以及含有 Gal4-UAS 或 QF-QUAS 下游野生型或突变型 Htt 转基因的品系。确保从这些转基因表达的蛋白质与荧光蛋白融合或贴上表位标记，以允许在同一只果蝇中分化突变型和野生型 Htt 转基因产物。参见图 1.
   注:我们通常使用人 Htt 基因的外显子 1 片段。然而，如果需要，可以生成转基因果蝇来表达更长的 Htt 片段或其他基因。
2. 规划遗传策略，使突变型和野生型 Htt 转基因在不同的、不重叠的细胞群中表达。
   1. 如果发生任何表达重叠，则在同一细胞中合成的突变型和野生型 Htt 蛋白将共聚集并阻止检测朊病毒样事件。为避免这种情况，请分别使用 Gal4 和 QF 特异性阻遏物 Gal80 和 QS40（图 1）。选择发育控制的 Gal4 和/或 QF 驱动因素有助于限制突变 Htt 向有丝分裂后细胞的表达，从而消除细胞分裂可能导致细胞间聚集体扩散的可能性。
3. 使用标准培养条件，与果蝇交配，产生在"供体"细胞群中通过 QF（或 Gal4）表达突变型 Htt 的后代，在"受体"细胞群中通过 Gal4（或 QF）表达野生型 Htt。参见图 1<....

Results

图 1.使用 QF-QUAS 和 Gal4-UAS 二元表达系统进行突变型和野生型 Htt 转基因偶联表达的遗传方法。在"细胞 A"中，含有致病长度 polyQ 延伸 （Q91） 的 mCherry 标记突变 Htt 蛋白使用位于组织特异性启动子 A （"PA"） 下游的 QF 驱动基因表达。在"细胞 B"中，含有正常 polyQ 拉伸 （Q25） 的 YFP 标记野生型 Htt 通过组织特异性启动子 B （"PB"） 控制的 Gal4 驱动基因表达。在图 2-4 中，Or67d-QF 用于驱动 DA1 ORNs 中的 QUAS-HttQ91-mCherry 表达，repo-Gal4 用于在所有神经胶质细胞 27 中表达 UAS-HttQ25-YFP。重要的是，HttQ91-mCherry 仅通过位于转基因上游的 QUAS 序列在表达 QF 的细胞中表达。同样，HttQ25-YFP 仅通过 Gal4 表达.......

Materials