成像与定量分析基因修饰细胞中的蛋白质聚集体 果蝇 大脑

摘要

来源：Donnelly, K. M., 等 在黑腹果蝇中监测类朊蛋白聚集体的细胞间传播。J. Vis. Exp. (2018)

本视频展示了在基因改造的 Drosophila 大脑中对蛋白质聚集体进行成像和定量分析。大脑组织经固定、洗涤并用抗荧光淬灭剂处理后封片。使用共聚焦显微镜采集图像，并进行定量分析以观察突变蛋白聚集体的传递情况。

方案

1. 在果蝇中耦合Gal4与QF介导的Htt转基因表达

1. 收集和/或构建含有组织特异性 Gal4 或 QF “驱动”元件的转基因黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）品系，以及构建含有野生型或突变型 Htt 转基因的品系，这些转基因位于 Gal4-UAS 或 QF-QUAS 系统的下游。确保这些转基因表达的蛋白质与荧光蛋白融合或带有表位标签，以便能够在同一只果蝇中区分突变型和野生型 Htt 转基因产物。参见 图1。
   注意：我们通常使用人源 Htt 基因的外显子1片段。然而，如有需要，也可构建表达更长 Htt 片段或其他基因的转基因果蝇。
2. 设计遗传策略，使突变型和野生型 Htt 转基因在彼此独立、无重叠的细胞群体中表达。
   1. 若存在任何表达重叠，同一细胞中合成的突变型和野生型 Htt 蛋白将共同聚集，从而阻碍朊病毒样传播事件的检测。为避免此情况，可分别使用 Gal4 和 QF 的特异性抑制因子 Gal80 和 QS40（图1）。选择发育阶段特异性调控的 Gal4 和/或 QF 驱动子，有助于将突变型 Htt 的表达限制在终末分化细胞中，从而排除细胞分裂对聚集物细胞间传播的潜在影响。
3. 在标准培养条件下，交配果蝇以获得子代，使突变型 Htt 通过 QF（或 Gal4）在“供体”细胞群中表达，而野生型 Htt 通过 Gal4（或 QF）在“受体”细胞群中表达。参见 图1 中所示可能的遗传组合示意图。
   注意：用于生成图1-4数据及我们先前发表文章中所用的 QF 和 Gal4 驱动子包括：DA1 嗅觉受体神经元（ORN）驱动子 Or67d-QF，以及泛胶质细胞驱动子 repo-Gal4。
4. 平行构建对照果蝇，使其在 QF 和 Gal4 标记的细胞群体中均表达野生型 Htt。
5. 收集具有目标基因型的子代，并根据实验需求进行相应年龄段的饲养。

2. 成年果蝇大脑的显微解剖与固定

注意：该解剖步骤已根据先前发表的方法进行了修改，可用于制备脑组织以直接成像Htt-荧光蛋白融合体的荧光信号。

1. 收集以下材料并置于冰上：含0.03% Triton X-100的磷酸盐缓冲液（PBS/T）；预先加入970 µL固定液的微量离心管，固定液为将200 µL 20%多聚甲醛加入770 µL PBS/T中配制而成（终浓度4%多聚甲醛，PFA）；一个带有孔洞的透明玻璃培养皿；一次性移液管；两把解剖镊子（一把为3号，一把为5号）。
2. 使用 CO 麻醉成年果蝇₂ 并将它们转移至冰上的玻璃培养皿的一个孔中。
3. 使用移液管，向含有果蝇的孔和一个空孔中各加入少量冷的 PBS/T（约 500 µL）。避免产生过多气泡，因为气泡可能干扰解剖操作。
4. 将玻璃培养皿置于解剖显微镜下方的平坦表面上，调节放大倍数，直至果蝇身体充满视野并清晰对焦。
5. 将一对鹅颈式光源放置在玻璃培养皿两侧，使光线照射到培养皿的两侧。在玻璃培养皿下方垫上折叠的实验室纸巾，用于丢弃解剖过程中分离的组织或几丁质外壳。
6. 用非惯用手持3号镊子，将一只果蝇转移至含有PBS/T的孔中。用镊子夹住果蝇腹部，使其腹面朝上，以固定果蝇。
7. 用优势手持5号镊子，在PBS/T溶液中保持果蝇完全浸没，移除果蝇头部。将镊子的一侧尖端插入果蝇头部一侧喙旁的小空隙处的角质层下方。通过夹紧镊子从两侧夹住复眼，牢固固定对头部的抓握。
8. 用镊子将果蝇头部从身体上拉下，将身体丢弃在附近放置的实验纸巾上。保持主手所持镊子的压力，以免丢失果蝇头部。
9. 用非优势手将3号镊子的一端尖部置于吻部另一侧角质层下方的相同微小空间内。定位后，夹紧镊子，以相同位置夹住头部两侧的复眼。
10. 一旦镊子牢固夹住角质层，轻轻将镊子向180°方向分开。此操作可使头部角质层裂开，同时不损伤脑组织。将角质层残渣丢弃在实验纸巾上。
    1. 尽管理想情况下应一步移除头部角质层，但有时可能无法做到。此时，需逐片移除角质层，直至大脑完全暴露。操作时需小心，避免镊子直接接触大脑，以防损伤。
11. 通过镊子尖端之间的毛细作用将脑组织吸入，或抓住附着的气管，从PBS/T中取出解剖得到的脑组织。
    注意： 气管的去除是可选步骤，因为气管通常不会遮挡我们通常用于成像的脑部前表面的触角叶。然而，如果气管干扰成像，则需小心将其去除，以避免此操作对脑组织造成损伤。
12. 将果蝇脑转移至预冷的含固定液的微量离心管中，确保脑组织脱离镊子并完全浸没于固定液中。
13. 所有脑组织解剖完成后，将封闭的离心管置于黑暗环境中，室温下于摇床上进行约5分钟的“短时间固定”。
    ​注意： 此短暂的固定步骤可使脑组织在后续操作中更易于处理，并防止其粘附在微量离心管管壁上。
14. 用 P1000 移液器吸出大部分固定液并弃去。
    1. 在此步骤及后续任何洗涤步骤中，避免吸出脑组织。将P1000移液器调至较低体积（例如650 µL），分两步移除上清液。此外，吸液时将微量离心管对准光源（如头顶灯光），以便更清楚地观察脑组织。
15. 加入 1 mL 新鲜的 PBS/T 到脑组织中，快速洗涤（< 避光孵育1分钟，吸去脑组织上清液并弃去。
16. 按照以下时间表，在室温避光条件下用 PBS/T 重复洗涤：2 次快速（< 1 分钟）洗涤，1 次 5 分钟，3 次 20 分钟，以及 1 次 1 小时洗涤。在微型离心管上盖紧管盖，并在每次洗涤间隔期间将管子置于旋转混合仪上。
    1. 若需进行 DAPI 染色，将最后一次 1 小时洗涤步骤替换为在 PBS/T 中稀释的 250 ng/mL DAPI 溶液中孵育 30 分钟（1 次），随后进行 2 次快速洗涤和 1 次 20 分钟洗涤。
17. 最后一次洗涤后，移除大部分洗涤缓冲液上清，注意不要扰动脑组织，向脑组织中加入30 µL基于甘油的抗荧光淬灭试剂。于4 °C避光、静置孵育至少1小时，最长可至24小时。

3. 全脑制片

1. 将载玻片置于解剖显微镜下，并用标识信息进行标记。
   ​注意：也可将脑组织直接固定在盖玻片上，以便在成像过程中观察脑的两侧。已有文献报道过该固定方法的详细方案45。
2. 使用钝化枪头（用剃刀片将1-200 µL枪头底部约1 cm处切去制备而成）从各个微量离心管中取出脑组织，并将其转移至载玻片中央。转移时尽量减少抗荧光淬灭剂的带入量。
3. 使用镊子将脑组织调整至所需方向（例如，背侧朝向载玻片上方，前侧朝上以利于触角叶成像）。在调整脑组织方向时，需考虑后续成像所用显微镜的光路路径。
4. 用折叠实验室纸巾的尖角吸除载玻片上多余的抗荧光淬灭剂，注意不要扰动脑组织。将载玻片置于避光环境中静置约5-10分钟，使脑组织充分贴附于载玻片表面。
5. 在果蝇脑组织四周各放置一小块破碎的盖玻片，形成一个约19 mm × 19 mm的正方形围栏。将一块22 mm × 22 mm、No. 1.5规格的盖玻片的一边置于其中一块小玻璃片外侧边缘，然后轻轻放下盖玻片，覆盖在脑组织上，完成桥式封片。
6. 缓慢加入新鲜的抗荧光淬灭剂，使液体逐渐充满盖玻片下方空间，注意避免扰动盖玻片或脑组织。使用折叠实验室纸巾的尖角轻轻擦去多余试剂，注意不要直接接触盖玻片。
7. 在盖玻片的四个角各滴加一滴透明快干指甲油，静置约10分钟使其干燥。随后用指甲油密封盖玻片的四条边缘，完全封闭脑组织。
8. 立即进行成像，或于4 °C保存至准备成像时使用。
   1. 若检测Htt-荧光蛋白融合蛋白的内在荧光信号，建议在24小时内完成成像以获得最佳信号强度。

4. 聚集体类朊病毒传播的成像与定量分析

1. 使用配备40X或60/63X油镜的共聚焦显微镜对已制备的脑组织进行成像，采集目标脑区的z轴切片图像，该区域为选定的Gal4和QF驱动子所表达的区域（图2A, B）。
   1. 使用适当的激光激发荧光蛋白融合体或免疫标记蛋白（例如，GFP/YFP/FITC使用488 nm激光，mCherry/Cy3使用552 nm激光）。设置检测窗口，以最大程度捕获荧光信号，同时利用光谱检测系统或针对每种荧光染料特异的带通/长通发射滤光片消除通道串扰。
      ​注意：在对蛋白聚集体成像时需格外注意。每个聚集体中心的像素容易发生饱和，尤其是在较大的聚集体中。应尽量减少图像中的饱和现象，但需意识到可能因此丢失较小聚集体的信号（图2B, C, D）。过度饱和会增加图像背景，使孤立的点状结构更难识别。在采集每组数据的最终图像前，应测试不同的成像参数以优化成像效果。
2. 通过手动逐层浏览z轴切片（例如，图2C和图4A），或在将共聚焦切片重建为三维图像后（图3A, B），对单个点状结构进行定量分析。
   注意： 此步骤可在Image J或其他图像处理软件中完成。
   1. 若聚集体分布清晰且背景荧光较低，可使用图像分析软件在共聚焦图像堆栈的三维重建中，将聚集体系统性地识别、定量并分析为独立的“对象”或“表面”（图3B）。
      注意： 所述软件操作针对本实验所用仪器和软件（参见材料表）。
      1. 以三维模式可视化共聚焦z系列图像。使用“分析”向导识别选定通道中的单个点状结构（例如，图3中红色通道的HttQ91-mCherry聚集体）。调整阈值和滤波器，以准确将不同大小的聚集体在图像中表示为独立对象。
      2. 在“二值化处理预滤波”中启用“分割对象”功能，以分离因软件算法异常合并的相邻聚集体。注意，对象总数及其相关测量值将在“测量”中报告。
         注意： 该方法不适用于免疫染色实验流程，因为淀粉样聚集体中心无法被抗体渗透，导致显微镜下聚集体呈现环状结构，图像分析软件难以准确识别和区分这些单个“点状结构”。
   2. 通过手动逐层浏览z轴图像堆栈，对野生型Htt聚集体进行定量计数，并确保在多个切片中出现的同一聚集体不被重复计数（图4A）。
      注意： 当每个共聚焦图像堆栈中聚集体数量适中（例如20–50个）时，可采用此手动定量方法。当图像分析软件无法将单个点状结构与同一通道中的周围信号（例如邻近细胞中弥散的野生型Htt信号）区分开时，该方法尤为有用（图2B, C 和 图4A）。野生型Htt聚集体的定量也可能具有挑战性，因为脑内许多正常结构也呈点状（例如细胞突起和突触）。可利用野生型与突变型Htt信号的共定位作为筛选标准；但需注意，某些突变型Htt“种子”可能低于共聚焦显微镜的检测限。可使用在受体细胞中不发生聚集的其他蛋白（例如GFP）标记脑内无关的点状结构，以辅助区分。
3. 使用图像分析软件对单个聚集体进行进一步表征。例如，确定聚集体的大小分布（图3C）、突变型与野生型Htt蛋白之间的共定位百分比（图4A），或通过FRET直接测量蛋白-蛋白相互作用（图4B）。
   1. 使用能准确识别特定通道中所有可见聚集体的点状或表面检测算法，确定单个点状结构的大小分布。利用图像分析软件对这些点或表面进行相关测量，例如从软件“分析”向导中“测量”部分获取“聚集体直径”（图3C）、“体积”或“强度”等信息。
      注意： 在图3C中，我们报告了单个DA1嗅小球中所有HttQ91-mCherry点状结构的直径分布。
   2. 通过逐层手动浏览共聚焦z轴图像堆栈，确定HttQ25-YFP与HttQ91-mCherry聚集体之间的共定位百分比（最准确的方法）。但需注意避免重复计数。为防止此问题，仅当焦平面穿过聚集体中心时，才在特定z切片中计数该聚集体（图4A）。
   3. 采用受体光漂白法，计算具有共定位HttQ91-mCherry信号的诱导HttQ25-YFP聚集体的FRET效率。
      1. 首先，通过设定仅mCherry和仅YFP信号的检测窗口，确保在另一通道中无信号，以消除YFP与mCherry通道之间的潜在串扰。使用这些设置，采集单个HttQ25-YFP点状结构及其相关HttQ91-mCherry信号的“前图像”（图4B）。
      2. 然后，将红色激光（例如552 nm）调至100%强度，进行光漂白直至mCherry信号消失。恢复至“前图像”采集设置，对同一位置的点状结构采集“后图像”（图4B）。
      3. 使用图像分析软件，测量每个点状结构在光漂白前后的荧光强度。
      4. 通过从“前图像”中测得的YFP供体荧光（YFPinitial）减去“后图像”中测得的YFP供体荧光（YFPfinal），计算FRET效率。将该差值除以YFPfinal，再乘以100。
         注意： FRET效率可对每个HttQ25-YFP聚集体整体计算，或逐像素计算（图4B）。当每个HttQ25-YFP点状结构相关的mCherry信号足够强，能在mCherry光漂白后产生可检测的YFP去淬灭时，受体光漂白法是计算FRET效率的特别有效技术。

结果

图1. 利用QF-QUAS和Gal4-UAS双元表达系统实现突变型与野生型Htt转基因偶联表达的遗传学方法。 在“细胞A”中，利用位于组织特异性启动子A（“PA”）下游的QF驱动子表达带有mCherry标签的突变型Htt蛋白，该蛋白包含致病长度的多聚谷氨酰胺序列（Q91）。在“细胞B”中，通过由组织特异性启动子B（“PB”）调控的Gal4驱动子表达带有YFP标签的野生型Htt蛋白，其含有多聚谷氨酰胺正常长度序列（Q25）。在图2-4中，Or67d-QF用于在DA1嗅觉受体神经元（DA1 ORNs）中驱动QUAS-Htt...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
磷酸盐缓冲液（PBS），10X，pH 7.4	ThermoFisher Scientific	AM9625	稀释至1X
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-1L
Kimwipes 擦镜纸	Thomas Scientific	2904F24
20% 多聚甲醛（PFA）	Electron Microscopy Sciences	15713-S
正常山羊血清（NGS），过滤	Lampire Biological Laboratories	7332500	收到后分装并冷冻保存
鸡抗GFP抗体	Aves Labs	GFP-1020	使用稀释比例为1:500
兔抗DsRed抗体	Clontech	632496	使用稀释比例为1:2000；可识别基于DsRed的荧光蛋白（例如mCherry、mStrawberry、tdTomato等）
小鼠抗Bruchpilot抗体	Developmental Studies Hybridoma Bank	nc82	使用稀释比例为1:100；可标记果蝇大脑中所有活跃的突触前结构
FITC标记的抗鸡IgG抗体	ThermoFisher Scientific	SA1-7200	使用稀释比例为1:250
Alexa Fluor 568标记的抗兔IgG抗体	Life Technologies	A11011	使用稀释比例为1:250
Alexa Fluor 647标记的抗小鼠IgG抗体	Life Technologies	A21235	使用稀释比例为1:250
Slowfade Gold 抗荧光淬灭封片剂	Life Technologies	S36936
显微镜载玻片（25 × 75 × 1.0 mm）	Fisher Scientific	12-550-143
盖玻片（22 × 22 mm）	Globe Scientific	1404-15
Dumont 生物级镊子，3号型	Ted Pella	503	用于非优势手
Dumont 生物级镊子，5号型	Ted Pella	505	用于优势手
LAS X 图像分析软件	Leica
Imaris 图像分析软件	Bitplane