成像与定量分析基因修饰细胞中的蛋白质聚集体 果蝇 大脑

摘要

来源：Donnelly, K. M., 等 在黑腹果蝇中监测类朊蛋白聚集体的细胞间传播。J. Vis. Exp. (2018)

本视频展示了在基因改造的 Drosophila 大脑中对蛋白质聚集体进行成像和定量分析。大脑组织经固定、洗涤并用抗荧光淬灭剂处理后封片。使用共聚焦显微镜采集图像，并进行定量分析以观察突变蛋白聚集体的传递情况。

方案

1. 在果蝇中耦合Gal4与QF介导的Htt转基因表达

1. 收集和/或构建含有组织特异性 Gal4 或 QF “驱动”元件的转基因黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）品系，以及构建含有野生型或突变型 Htt 转基因的品系，这些转基因位于 Gal4-UAS 或 QF-QUAS 系统的下游。确保这些转基因表达的蛋白质与荧光蛋白融合或带有表位标签，以便能够在同一只果蝇中区分突变型和野生型 Htt 转基因产物。参见 图1。
   注意：我们通常使用人源 Htt 基因的外显子1片段。然而，如有需要，也可构建表达更长 Htt 片段或其他基因的转基因果蝇。
2. 设计遗传策略，使突变型和野生型 Htt 转基因在彼此独立、无重叠的细胞群体中表达。
   1. 若存在任何表达重叠，同一细胞中合成的突变型和野生型 Htt 蛋白将共同聚集，从而阻碍朊病毒样传播事件的检测。为避免此情况，可分别使用 Gal4 和 QF 的特异性抑制因子 Gal80 和 QS40（图1）。选择发育阶段特异性调控的 Gal4 和/或 QF 驱动子，有助于将突变型 Htt 的表达限制在终末分化细胞中，从而排除细胞分裂对聚集物细胞间传播的潜在影响。
3. 在标准培养条件下，交配果蝇以获得子代，使突变型 Htt 通过 QF（或 Gal4）在“供体”细胞群中表达，而野....

结果

图1. 利用QF-QUAS和Gal4-UAS双元表达系统实现突变型与野生型Htt转基因偶联表达的遗传学方法。 在“细胞A”中，利用位于组织特异性启动子A（“PA”）下游的QF驱动子表达带有mCherry标签的突变型Htt蛋白，该蛋白包含致病长度的多聚谷氨酰胺序列（Q91）。在“细胞B”中，通过由组织特异性启动子B（“PB”）调控的Gal4驱动子表达带有YFP标签的野生型Htt蛋白，其含有多聚谷氨酰胺正常长度序列（Q25）。在图2-4中，Or67d-QF用于在DA1嗅觉受体神经元（DA1 ORNs）中驱动QUAS-Htt.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
磷酸盐缓冲液（PBS），10X，pH 7.4	ThermoFisher Scientific	AM9625	稀释至1X
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-1L
Kimwipes 擦镜纸	Thomas Scientific	2904F24
20% 多聚甲醛（PFA）	Electron Microscopy Sciences	15713-S
正常山羊血清（NGS），过滤	Lampire Biological Laboratories	7332500	收到后分装并冷冻保存
鸡抗GFP抗体	Aves Labs	GFP-1020	使用稀释比例为1:500
兔抗DsRed抗体	Clontech	632496	使用稀释比例为1:2000；可识别基于DsRed的荧光蛋白（例如mCherry、mStrawberry、tdTomato等）
小鼠抗Bruchpilot抗体	Developmental Studies Hybridoma Bank	nc82	使用稀释比例为1:100；可标记果蝇大脑中所有活跃的突触前结构
FITC标记的抗鸡IgG抗体	ThermoFisher Scientific	SA1-7200	使用稀释比例为1:250
Alexa Fluor 568标记的抗兔IgG抗体	Life Technologies	A11011	使用稀释比例为1:250
Alexa Fluor 647标记的抗小鼠IgG抗体	Life Technologies	A21235	使用稀释比例为1:250
Slowfade Gold 抗荧光淬灭封片剂	Life Technologies	S36936
显微镜载玻片（25 × 75 × 1.0 mm）	Fisher Scientific	12-550-143
盖玻片（22 × 22 mm）	Globe Scientific	1404-15
Dumont 生物级镊子，3号型	Ted Pella	503	用于非优势手
Dumont 生物级镊子，5号型	Ted Pella	505	用于优势手
LAS X 图像分析软件	Leica
Imaris 图像分析软件	Bitplane