在小鼠模型中制造皮层刺伤以诱导反应性星形胶质细胞增生

摘要

来源：Allahyari, R. V. 等 诱导反应性胶质增生 体内 通过前脑刺伤损伤。 视频实验杂志 (2015)

本视频演示了小鼠皮层刺伤损伤的操作过程，包括颅骨暴露和脑损伤的建立。该模型可诱导反应性星形胶质细胞增生，即星形胶质细胞的一种神经保护性反应，用于研究中枢神经系统创伤、炎症及修复机制。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 手术前小鼠的准备

1. 将小鼠从饲养笼中取出并称重（g）。
2. 将小鼠放入异氟烷诱导室，设置氧气流速为 2 L/min，异氟烷蒸发器浓度为 5%，以诱导外科麻醉状态，约需 3–5 分钟。观察呼吸减慢和运动停止，并通过脚趾夹捏反射确认小鼠已完全麻醉。
3. 当小鼠完全麻醉后，将其固定于立体定位仪中，将鼻部置入与异氟烷管路相连的鼻锥内；将耳杆插入耳道并拧紧，确保头部稳定。
4. 剃除从一侧耳至另一侧耳、以及从两眼之间向后至耳后的头部毛发。
5. 使用异丙醇和聚维酮碘溶液交替擦拭消毒皮肤，每种溶液各擦拭三次。
6. 在双眼表面涂抹人工泪液，以防止手术过程中角膜干燥。

2. 手术操作

1. 通过捏压小鼠脚趾或尾巴来监测麻醉深度。当小鼠无反应且呼吸缓慢均匀时，表明其已达到适当的手术麻醉平面。
2. 使用11号手术刀片，从眼睛后方开始，沿一条坚定的单一切口动作，向接近两耳之间位置做矢状旁切口。将皮肤拨开，并用止血钳夹住右侧固定。
3. 使用11号手术刀片的钝面和棉签清除颅骨表面的覆盖膜。可选步骤：用浸有0.9%生理盐水的棉签擦拭颅骨，然后彻底晾干。
4. 使用小尺子，用永久性记号笔标记开颅区域的前界（冠状缝后方1 mm）和左界（矢状缝外侧1 mm）（图1）；然后分别从矢状缝和冠状缝起向外4 mm处标记开颅区域的右界和后界（图1）。
5. 使用0.5 mm钻头，沿永久记号笔标记的轮廓缓慢钻孔，开始进行开颅操作。注意不要完全穿透颅骨。使用5号镊子轻轻按压分离出的顶骨部分，薄弱区域会在压力下破裂。当钻薄的骨片在整个边缘区域均足够脆弱时，即可准备移除。
   注意：如果研究者难以完整取出骨片，说明钻孔过程中骨片未充分变薄。建议在后续动物实验中进一步钻孔，以便于骨片顺利移除。
6. 使用装有23 G针头的10 ml注射器，滴加少量0.9%生理盐水，润湿分离的骨片及钻孔区域。
7. 将操纵臂连接至立体定位仪设备上。将新的11号手术刀片安装到探针夹持器上，确保刀片锋利边缘朝向前脑方向。
   注意：尽管前脑和后脑组织分别接触刀片的锋利侧和钝侧，但穿透性损伤所引起的机械性破坏在整个损伤范围内是相似的。我们在前脑和后脑切片中观察到反应性胶质增生的主要特征（包括GFAP表达上调和细胞增殖）无明显差异。
8. 将操纵臂移开操作区域，小心使用5/45角度镊子抬起分离的骨片。将镊子尖端插入骨片一侧，利用杠杆作用一次性完整撬起残留的骨片。
   注意：操作时需小心，避免刺伤脑组织或扰动颅骨下方的硬脑膜。
9. 取一小块浸湿的可吸收明胶海绵，放置在暴露的脑组织表面，以防止脑组织干燥，并吸收可能存在的血液。
10. 明胶海绵放置妥当后，将操纵臂移至适当位置，并调整刀片使其对准开颅区域中央的明胶海绵上方。移除明胶海绵，缓慢下放刀片，直至刀尖接触硬脑膜但未穿破。使用立体定位仪垂直臂上的游标尺标记背侧/腹侧坐标。
11. 通过操纵臂，将刀片精确地缓慢下压进入脑组织3 mm。此操作可通过操纵臂上的游标刻度实现。让刀片在原位停留5–10秒。随后，将带有刀片的立体定位臂从前脑向后脑方向移动三次，在每次移动前确保刀片到达开颅区域的前界和后界。
    注意：插入刀片前无需切除硬脑膜。与大鼠约80 μm厚的硬脑膜相比，小鼠硬脑膜明显更薄（仅数个细胞层厚度），在插入过程中不会对刀片产生明显阻力。为确保每只动物损伤的一致性，每次实验均应使用新的手术刀片。
12. 缓慢抬起立体定位臂，将刀片从脑组织中退出。刀片取出后，立即在脑表面放置另一块明胶海绵，以吸收多余的血液或液体。
13. 同时，取下立体定位臂并丢弃11号手术刀片。待出血停止后，移除明胶海绵。
14. 使用不可吸收缝线（如Ethilon或Prolene）缝合皮肤以关闭切口。缝线应在术后9–10天拆除。
15. 将小鼠放回其饲养笼中，并置于加热垫上缓慢恢复，密切监测是否有任何痛苦迹象。在停止异氟烷麻醉后，通常2–5分钟内即可恢复意识。在动物恢复胸卧位之前，不得无人看护。
16. 皮下注射0.5–1 ml乳酸林格液，以确保动物充分水化。

结果

图1：小鼠颅骨示意图，显示颅骨开窗区域。 蓝线表示最初标记的钻孔区域边界。上方和左侧标记点分别位于冠状缝下方或矢状缝外侧1 mm处。下方和右侧标记点分别距离冠状缝和矢状缝4 mm。通过在标记范围内钻出一个圆形区域（虚线），形成直径约3 mm的颅骨开窗（虚线）。该示意图未按比例绘制。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
立体定位仪	Harvard Apparatus	726049
高速微型钻	Harvard Apparatus	724950
不锈钢手术刀片，#11	MedVet	JOR581S
5/45 角度镊子	Fine Science Tools	11251-35
明胶海绵，12 cm × 7 mm	Fisher	NC9841478
抗体及其他试剂	制造商	目录编号	明场稀释比例 荧光稀释比例
兔抗 GFAP 抗体	DAKO	Z033429-2	1:20,000 1:1,000
羊抗 BrdU 抗体	Abcam	ab1893	1:2,000 1:500
生物素标记的山羊抗兔 IgG	Vector Laboratories	BA-1000	07:40
生物素标记的兔抗羊 IgG	Vector Laboratories	BA-6000	07:40
Alexa Fluor 488 标记山羊抗兔 IgG	Life Technologies	A-11008	07:40
Alexa Fluor 568 标记驴抗羊 IgG	Life Technologies	A-21099	17:40
DAPI 核酸染色剂	Life Technologies	D3571	17:40
醋酸克雷斯尔紫	Sigma Aldrich	C5042-10G	1%