评估小鼠大脑中细菌定植情况 单核细胞增生李斯特菌 感染

摘要

来源：Ghosh, P., 等，脑部 Listeria monocytogenes 感染。视觉化实验杂志（2018）

本视频展示了从感染并经灌流的小鼠脑组织中定量可培养细菌载量的方法 单核细胞增生李斯特菌.

方案

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。 

1. 器官采集与细菌载量测定

1. 灌流后，仔细去除器官（例如肝脏、脾脏）上附着的血管和韧带，分别放入含有5 mL无菌冷（4 °C）PBS的无菌15 mL锥形管中。将样本置于冰上保存，直至进一步处理。
2. 取脑时，用剪刀在耳后剪下头部，并沿动物两眼之间中线切开头皮。如有需要，修剪多余组织，剪刀应紧贴颅骨表面。
   1. 将剪刀的一侧尖端轻轻插入枕骨大孔（脊髓穿过的颅底孔洞），然后向两侧横向剪开颅骨。
   2. 沿啮齿类动物两眼之间中线剪开颅骨，施加侧向压力。避免扰动脑组织，尽量减少脑组织与剪刀的接触。
   3. 使用精细尖头镊子打开颅骨以暴露脑组织，将刮勺置于脑组织下方与颅底之间，完整取出脑组织。
      注意：此操作会导致脑神经纤维断裂。
   4. 小心将脑组织转移至含有5 mL无菌冷PBS的15 mL锥形管中。
   5. 丢弃小鼠尸体，并对剩余动物重复上述步骤。
      注意：所有器官采集完毕后，清洁操作区域，准备进行器官匀浆以测定细菌载量。
3. 在生物安全柜中，将组织匀浆器的探头依次插入分别装有5%次氯酸钠、无菌水、75%乙醇和无菌水的独立15 mL锥形管中，每次运行匀浆器10秒，以清洁并灭菌探头。
4. 在15 mL锥形管中对感染脑组织进行匀浆（设置为6档，约20秒，达到最高转速），直至无可见组织碎片残留。
   1. 按照步骤1.3所述方法清洁匀浆器，防止细菌交叉污染至下一个器官样本。
   2. 对所有其他器官（例如肝脏、脾脏）执行相同的匀浆过程。
   3. 匀浆完成后，按照步骤1.3所述方法清洁匀浆器，并妥善保存以备后续使用。
5. 用无菌PBS对器官匀浆液进行10倍系列稀释，并将稀释液接种于BHI琼脂/链霉素平板上，以测定每个器官的菌落形成单位（CFU）。
   注意：采用类似方法可测定每毫升血液中的CFU。
   1. 所有稀释液接种完成后，将平板置于37 °C培养箱中过夜培养。
   2. 次日，计数各平板上的菌落数量，按以下公式计算每个器官或每毫升血液中的总细菌数：
      每器官CFU = （菌落数 × 稀释倍数）/ 接种的匀浆液体积（mL）× 5
      每毫升血液CFU = （菌落数 × 稀释倍数）/ 接种的血液体积（mL）

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
脑心浸液培养基	Becton Dickinson	237200
硫酸链霉素	Amresco	0382-50G
培养皿	VWR	25384-342
甘油	VWR	97062-832
IKA T18 ULTRA-TURRAX Basic 匀浆器	IKA	3352109	型号：T18BS1
分光光度计	Beckman Coulter	DU 800 系列
BALB/c 小鼠	Jackson Laboratory	型号 #000651
乙二胺四乙酸	Sigma-Aldrich	60004
15 ml 锥形管	VWR	21008-918
磷酸盐缓冲液	Corning	46-013-CM
不锈钢刮勺	VWR	82027-520
不锈钢剪刀（4.5 英寸）	VWR	82027-578
不锈钢细尖镊子（6 英寸）	VWR	82027-406