饮食诱导肥胖斑马鱼中食欲素与大麻素受体共定位的检测

摘要

来源：Imperatore, R., 等 利用免疫过氧化物酶法和免疫荧光法鉴定成年斑马鱼中的食欲素和内源性大麻素受体。J. Vis. Exp. (2019)。

本视频展示了一种利用免疫荧光技术研究正常及饮食诱导肥胖（DIO）成年斑马鱼脑组织中食欲素受体与大麻素受体共定位的实验方案。

方案

所有涉及动物样本的实验程序均已通过相应的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 免疫荧光实验方案

1. 组织解剖
   1. 将斑马鱼浸入冰水（5份冰/1份水，4 °C）中处死；保持至所有运动完全停止，以确保因缺氧而死亡。
   2. 使用剃刀片去除头部。用镊子清除颅骨腹侧的软组织。打开颅骨，并移除脑腹侧的骨组织。去除脑背侧的皮肤和颅骨。取出脑组织。
2. 组织固定
   1. 将脑组织浸入4%多聚甲醛（PFA）中，在4 °C下固定3小时。
      1. 通过将1.755 g NaH₂PO₄H₂O 和4.575 g Na₂HPO₄ 溶解于450 mL蒸馏水（dH₂O）中，配制0.1 M磷酸盐缓冲液（PB），并用适量1N NaOH调节pH至7.4。
      2. 通过在加热板上搅拌，将4 g PFA溶解于100 mL 0.1 M PB（pH 7.4）中配制4% PFA溶液。当温度达到60 °C时，加入2–4滴1N NaOH，以获得澄清溶液。将4% PFA置于室温（RT）下，检测pH值，并调节至7.4。
         注意：固定时间取决于组织大小。固定超过4–6小时可能导致过度固定，从而掩盖抗原，限制抗体与表位的结合。
3. 组织包埋
   1. 用0.1 M PB（pH 7.4）清洗组织，每次5分钟，共3次。
   2. 进行冷冻保护：将组织转移至含20%蔗糖的PB（0.1 M，pH 7.4）溶液中，于4 °C下过夜。随后将组织转移至含30%蔗糖的0.1 M PB（pH 7.4）溶液中，再于4 °C下保存一晚。
   3. 将组织包埋于最佳切割温度（OCT）包埋剂中。为此，准备少量液氮，取铝箔并剪成两半制成小皿。将含有组织并充满OCT包埋剂的小皿浸入液氮中，直至OCT完全冷却。冷冻后的组织可于-80 °C保存，直至切片使用。
4. 组织切片
   1. 将冷冻组织块转移至-20 °C的恒冷切片机中，切成10 μm厚的冠状面或矢状面切片。
   2. 将切片交替收集到适用于免疫组织化学的防脱玻片上，并于-20 °C保存备用。
      注意：将玻片置于-20 °C至4 °C之间，存放在避光的玻片盒或玻片册中。
5. 封闭非特异性结合位点及组织通透处理
   1. 使用耐溶剂笔在玻片上标记组织区域。
   2. 用0.1 M PB（pH 7.4）清洗切片，每次5分钟，共3次。
   3. 在室温下，用含1%正常驴血清的通透缓冲液PB-Triton X-100 0.3%（PB-T）孵育切片30分钟，以通透细胞膜并封闭非特异性结合位点。
      1. 将0.3 mL Triton X-100溶解于100 mL 0.1 M PB（pH 7.4）中，配制0.3% Triton X-100溶液。
      2. 将1%正常驴血清溶解于含0.3% Triton X-100的PB中，配制封闭液。
         注意：通透和封闭缓冲液中所用血清的动物种属取决于二抗的宿主来源。
6. 与一抗混合液孵育
   1. 用0.1 M PB（pH 7.4）清洗切片，每次5分钟，共3次。
      1. 在湿盒中，于室温下用稀释于PB-T中的混合一抗溶液孵育切片过夜。可使用以下一抗组合：抗食欲素受体（OX-2R）山羊抗体（1:100稀释）与抗大麻素受体（CB1R）兔抗体（1:100稀释），或抗食欲素肽（OX-A）山羊抗体（1:100稀释）与抗CB1R兔抗体（1:100稀释）。
7. 与二抗混合液孵育
   1. 用0.1 M PB（pH 7.4）清洗切片，每次5分钟，共3次。
   2. 在室温下，用以下任一混合二抗溶液孵育切片2小时：1）驴抗兔Alexa Fluor 488标记二抗与驴抗山羊Alexa Fluor 594标记二抗，按1:100比例稀释于PB-T中；或2）驴抗山羊Alexa Fluor 488标记二抗与驴抗兔Alexa Fluor 594标记二抗，按1:100比例稀释于PB-T中。
      注意：应使用同一动物宿主来源的二抗。正常血清必须与二抗同源（例如，使用驴来源的二抗时，应使用驴正常血清）。使用含去垢剂的封闭缓冲液稀释一抗和二抗，以增强细胞通透性并降低背景信号。
8. 组织封片
   1. 用0.1 M PB（pH 7.4）清洗切片，每次5分钟，共3次。
   2. 用核染料DAPI（4’,6-二脒基-2-苯基吲哚）对切片进行复染，配制方法为将1.5 µL DAPI（1 mg/mL）溶解于3 mL PB中。
   3. 用封片剂覆盖玻片（参见材料表）。该水性封片剂可长期稳定组织样本及染色。荧光样本应避光保存于4 °C。为延长荧光染料寿命，建议使用抗荧光淬灭封片剂。
      注意：应选择合适的封片剂。封片剂最重要的参数之一是折射率（nD），应接近1.5（玻璃的折射率）。此处使用的封片剂特别适用于酶和脂质测定样本（即不能用梯度酒精脱水的样本）。
9. 对照实验
   1. 重复步骤1.1–1.8，但在孵育过程中省略一抗或二抗，或在特定步骤中用PB替代一抗或二抗（阴性对照）。
   2. 重复步骤1.1–1.8，将每种一抗与过量对应的肽段（100 mg肽段/1 mL稀释抗血清）预先吸附处理。
   3. 在小鼠脑切片上重复步骤1.1–1.8（阳性对照）。
      注意：所有缓冲液均需在使用前新鲜配制。每一步操作中，应小心用移液器或滤纸吸除切片周围的多余液体，同时始终保持切片湿润。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗 CB1 抗体	Abcam	ab23703
抗 OX-2R 抗体	Santa Cruz	sc-8074
抗 OXA 抗体	Santa Cruz	sc8070
冷冻切片机	Leica Biosystem	CM3050S
DAPI	Sigma Aldrich	32670
驴抗山羊 Alexa Fluor 488 标记二抗	Thermo Fisher	A11055
驴抗山羊 Alexa Fluor 594 标记二抗	Thermo Fisher	A11058
驴抗兔 Alexa Fluor 488 标记二抗	Thermo Fisher	A21206
驴抗兔 Alexa Fluor 594 标记二抗	Thermo Fisher	A21207
无水乙醇	VWR	2,08,21,330
冷冻切片包埋剂	Leica Biosystem	FSC 22 Frozen Section Media
HCl	VWR	2,02,52,290
ImmPACT DAB 显色试剂	Vector lab	SK4105
显微镜	Leica Biosystem	DMI6000
切片机	Leica Biosystem	RM2125RT
Na2HPO4	Sigma Aldrich	S9763
NaCl	Sigma Aldrich	S7653
NaH2PO4·H2O	Sigma Aldrich	S9638
NaOH	Sigma Aldrich	S8045
正常驴血清	Sigma Aldrich	D9663
正常兔血清	Vector lab	S-5000
多聚甲醛	Sigma Aldrich	P6148
吐温-20 (Triton X-100)	Fluka Analytical	93420
Trizma	Sigma Aldrich	T1503
VectaStain Elite ABC 试剂盒	Vector lab	PK6100