研究FITC和FITC-铁蛋白通过体外血脑屏障模型的渗透性

摘要

来源：Fiandra, L., 等 体外 载荧光素异硫氰酸酯的铁蛋白穿越大鼠血脑屏障：纳米制剂分子递送研究模型 视频实验杂志 (2016).

本视频展示了一种利用膜插件上培养的星形胶质细胞和内皮细胞构建的体外血脑屏障（BBB）模型来研究物质渗透的方法，实验中使用了游离的FITC和负载FITC的铁蛋白。FITC标记的铁蛋白可与内皮细胞表面的受体结合，并穿过膜屏障进入下室，而游离FITC的渗透受到限制，主要保留在上室。

方案

1. 建立血脑屏障模型

注意：为建立血脑屏障（BBB）模型，建议使用市售的原代大鼠脑微血管内皮细胞（RBMECs）和大鼠皮层星形胶质细胞（RCAs）。所有步骤必须使用无菌试剂和一次性耗材，并在层流罩内进行操作。

1. 细胞培养
   1. 使用聚-L-赖氨酸（100 µg/mL，室温 RT 孵育 1 小时）或纤维连接蛋白（50 µg/mL，37 °C 孵育 1 小时）包被细胞培养瓶，以分别促进 RCAs 或 RBMECs 的贴壁。随后，在内皮细胞培养基中解冻 1 × 10⁶ 个 RCAs 和 5 × 10⁵ 个 RBMECs，该培养基补充有 5% 胎牛血清、1% 内皮细胞生长添加剂和 1% 青霉素/链霉素（sECM）。将 RCAs 以 20 mL sECM 接种至 T175 培养瓶中，将 RBMECs 以 10 mL sECM 接种至 T75 培养瓶中。
      注意：RCAs 和 RBMECs 的解冻与接种代次需根据拟用于血脑屏障（BBB）模型测试的实验条件数量，对细胞密度和培养时间进行相应调整。从 1 瓶 1 × 10⁶ 个 RCAs 和 1 瓶 5 × 10⁵ 个 RBMECs 开始，最多可获得 20 个携带 BBB 的插入式培养小室。
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结果

图1：细胞接种至小室膜上。 将RCA（A）和RBMEC（B）分别接种至多孔板小室膜两侧的操作流程。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
大鼠脑微血管内皮细胞	Innoprot	P10308	从 Sprague Dawley 大鼠脑组织中分离，第1代冻存并冷冻运输
皮层星形胶质细胞	Innoprot	P10202	从出生2天的大鼠脑组织中分离，第1代冻存并冷冻运输
内皮细胞培养基试剂盒	Innoprot	P60104	ECM（500 ml）、胎牛血清（25 ml）、内皮细胞生长添加剂（5 ml）和青霉素/链霉素（5 ml）。使用前在37 °C水浴中预热，并避光保存
无酚红胰蛋白酶-EDTA	EuroClone	ECM0920D	使用前在37 °C水浴中预热
异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖 40000	Sigma	FD40S	避光保存
不含钙和镁的杜氏磷酸盐缓冲液	EuroClone	ECB4004L
曲拉通 X-100	Sigma	T8787
牛血清白蛋白	Sigma	A7906
山羊血清	EuroClone	ECS0200D
聚-L-赖氨酸氢溴酸盐	Sigma	P1274	同一溶液可多次使用
牛血浆来源的纤连蛋白	Sigma	F1141	同一溶液可多次使用
聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）小室插件	Falcon	F3090	透明聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）膜；表面积：4.2 cm²；孔径：0.4 µm/表面积
T75 Primo TC 培养瓶	EuroClone	ET7076
T175 Primo TC 培养瓶	EuroClone	ET7181
EVOM2 上皮组织电压/电阻计	World Precision Instruments Germany	EVOM2
Endohm-24SNAP 测量杯	World Precision Instruments Germany	ENDOHM-24SNAP
带相机的明场/荧光显微镜	Leica Microsystems	DM IL LED Fluo/ ICC50 W Camera Module	用于活细胞观察的倒置显微镜，配备相机
共聚焦显微镜	Leica Microsystems	TCS SPE