来源：Fiandra, L., 等 体外 载荧光素异硫氰酸酯的铁蛋白穿越大鼠血脑屏障：纳米制剂分子递送研究模型 视频实验杂志 (2016).
本视频展示了一种利用膜插件上培养的星形胶质细胞和内皮细胞构建的体外血脑屏障（BBB）模型来研究物质渗透的方法，实验中使用了游离的FITC和负载FITC的铁蛋白。FITC标记的铁蛋白可与内皮细胞表面的受体结合，并穿过膜屏障进入下室，而游离FITC的渗透受到限制，主要保留在上室。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
方法文章
研究FITC和FITC-铁蛋白通过体外血脑屏障模型的渗透性
1.2K 次观看
⸱
2025年7月8日
本文内容
摘要
方案
1. 建立血脑屏障模型
注意：为建立血脑屏障（BBB）模型，建议使用市售的原代大鼠脑微血管内皮细胞（RBMECs）和大鼠皮层星形胶质细胞（RCAs）。所有步骤必须使用无菌试剂和一次性耗材，并在层流罩内进行操作。
- 细胞培养
- 使用聚-L-赖氨酸（100 µg/mL，室温 RT 孵育 1 小时）或纤维连接蛋白（50 µg/mL，37 °C 孵育 1 小时）包被细胞培养瓶，以分别促进 RCAs 或 RBMECs 的贴壁。随后，在内皮细胞培养基中解冻 1 × 106 个 RCAs 和 5 × 105 个 RBMECs，该培养基补充有 5% 胎牛血清、1% 内皮细胞生长添加剂和 1% 青霉素/链霉素（sECM）。将 RCAs 以 20 mL sECM 接种至 T175 培养瓶中，将 RBMECs 以 10 mL sECM 接种至 T75 培养瓶中。
注意：RCAs 和 RBMECs 的解冻与接种代次需根据拟用于血脑屏障（BBB）模型测试的实验条件数量，对细胞密度和培养时间进行相应调整。从 1 瓶 1 × 106 个 RCAs 和 1 瓶 5 × 105 个 RBMECs 开始，最多可获得 20 个携带 BBB 的插入式培养小室。 - 将细胞在 37 °C、5% CO2 的湿润环境中培养约 6 天，直至 RCAs 达到约 80% 汇合度，RBMECs 超过 90% 汇合度。使用胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（胰蛋白酶-EDTA）溶液（胰蛋白酶 1:250）消化 5 分钟（T75 培养瓶加 1 mL 胰蛋白酶，T175 培养瓶加 2 mL），用 sECM（按 2:1 比例）终止胰蛋白酶活性，以 750 × g 离心 5 分钟，弃上清，将细胞沉淀重悬于 60 mL sECM 中。
- 将 RBMECs 分种至 3 个 T175 培养瓶中，继续在 sECM 中培养 3 天，之后接种至插入式培养小室上。取细胞悬液与台盼蓝按 1:1 比例稀释后，在光学显微镜下使用布氏细胞计数板观察，计数活 RCAs 的总数。
- 使用聚-L-赖氨酸（100 µg/mL，室温 RT 孵育 1 小时）或纤维连接蛋白（50 µg/mL，37 °C 孵育 1 小时）包被细胞培养瓶，以分别促进 RCAs 或 RBMECs 的贴壁。随后，在内皮细胞培养基中解冻 1 × 106 个 RCAs 和 5 × 105 个 RBMECs，该培养基补充有 5% 胎牛血清、1% 内皮细胞生长添加剂和 1% 青霉素/链霉素（sECM）。将 RCAs 以 20 mL sECM 接种至 T175 培养瓶中，将 RBMECs 以 10 mL sECM 接种至 T75 培养瓶中。
- 细胞接种至插入式培养小室
- 对 6 孔透明插入式培养小室的聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）膜一侧使用聚-L-赖氨酸（100 µg/mL）处理，另一侧使用纤维连接蛋白（50 µg/mL）处理，以分别促进 RCAs 和 BMECs 的贴附。操作时应使用镊子夹持小室，避免接触 PET 膜。
- 将插入式培养小室放入 6 孔板中，在上室加入纤维连接蛋白溶液（至少 500 µL），37 °C 孵育 1 小时后，吸除纤维连接蛋白溶液，将小室从多孔板中取出并倒置放置于一个 150 cm2 培养皿底部，该培养皿在此作为已包被小室的无菌支撑物。
- 轻柔地将 800 µL 聚-L-赖氨酸加至小室底部（如图 1A所示；称为 RCAs 接种面），在室温下孵育 1 小时。
- 吸除溶液，让小室在室温下干燥 15–30 分钟。此时小室已可进行细胞接种，也可在 4 °C 下置于多孔板中保存数天，待后续进行 BBB 构建。
注意：请至少保留 3 个已包被但未接种细胞的小室作为空白对照，用于通过 FD40 渗漏检测验证 BBB 的建立。
- 将 RCAs（35,000/cm2）以 800 µL 细胞悬液滴加至倒置的小室底部（即聚-L-赖氨酸包被面）进行接种（图 1A）。在室温下静置 4 小时，以确保细胞有效贴附于膜上。
- 吸除残留液体，将小室放入含 2 mL sECM 的孔中，并将 6 孔板置于 37 °C、5% CO2 的湿润环境中培养，每 2 天更换一次 sECM。
- 3 天后，当 RCAs 已完全覆盖小室下表面时，按以下步骤将 RBMECs 接种至小室上表面：
- 从 T175 培养瓶中消化 RBMECs，并按照步骤 1.1.2 和 1.1.3 所述方法计数活细胞总数。
- 将 RBMECs（60,000/cm2）以 1,000 µL sECM 接种至小室上表面（图 1B），并保留 3 个小室仅含星形胶质细胞，作为空白背景用于跨内皮电阻（TEER）测量。将 6 孔板置于标准培养条件下，继续培养至少 3 天，每 2 天更换内室和外室的 sECM。
- 对 6 孔透明插入式培养小室的聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）膜一侧使用聚-L-赖氨酸（100 µg/mL）处理，另一侧使用纤维连接蛋白（50 µg/mL）处理，以分别促进 RCAs 和 BMECs 的贴附。操作时应使用镊子夹持小室，避免接触 PET 膜。
2. 血脑屏障验证
- 跨上皮电阻（TEER）测量
- 第3天rd 共培养当天，将含有血脑屏障的插入式培养小室放入合适的检测腔室（带盖，且腔室和盖子均配有电压感应和电流电极），腔室中加入4 ml sECM。连接上上皮组织电压/电阻测量仪，检测TEER值。
- 在对细胞血脑屏障（BBB）系统进行TEER测量的同时，记录3个承载电阻抗阵列（RCAs）的插入式培养小室的TEER值，并从BBB系统测得的数值中减去这些值。将校正后的TEER值乘以插入式培养小室的表面积（4.2 cm²）。2以 Ω × cm 表示结果2.
- 从第3个rd 共培养当天起，每天测量TEER。 注意： 在初始阶段经皮电阻（TEER）升高后，记录的数值应至少连续两天保持稳定（通常在第5天th 以及 7th 共培养的第几天）。此时，血脑屏障模型已准备好进行第二步验证（第2.2节）和/或跨血脑屏障实验。
注意：第2.1节中描述的操作可在用于后续通透性实验（第3节）的同一BBB系统上进行。操作过程中需保持无菌条件。
3. 载有FITC的铁蛋白（FnN）跨血脑屏障渗透
注意：一种在大肠杆菌（Escherichia coli）中表达并组装成纳米笼结构的重组人铁蛋白（Fn）变体（FnN）。FnN 被装载荧光素异硫氰酸酯（FITC），且 Fn 及其装载分子的浓度均已精确测定。
- FITC与FITC-FnN的跨血脑屏障转运
- 测量经验证的血脑屏障模型中FITC-FnN从上室到下室的通量（通常在5th - 7th 共培养第7小时和24小时，按照以下步骤，与游离染料相比。
- 向每种配方的至少6个BBB系统上室中加入FITC-FnN（50 µg/ml FnN，1.1 µM FITC）或等量的游离FITC，分别在7小时和24小时后，从其中至少3个插件的下室中取出2 ml sECM溶液，另从其余3个插件的下室中取出2 ml sECM溶液。
- 使用荧光分光光度计测量所收集样品500 µl的荧光强度（λex 488 nm, λem 515 nm，狭缝 5）
- 使用相同的分析参数测量500 µl培养基以获得sECM背景荧光。从所有FITC或FITC-FnN荧光值中减去sECM背景荧光。
- 通过将测得的荧光值与两种已知浓度绘制的标准曲线进行比较，确定透过的FITC或FITC-FnN的浓度即. 6.87、13.75、27.5、55 nM）的游离或纳米制剂染料溶解于 500 µl sECM 中。
- 测量经验证的血脑屏障模型中FITC-FnN从上室到下室的通量（通常在5th - 7th 共培养第7小时和24小时，按照以下步骤，与游离染料相比。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
图1：细胞接种至小室膜上。 将RCA（A）和RBMEC（B）分别接种至多孔板小室膜两侧的操作流程。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 大鼠脑微血管内皮细胞 | Innoprot | P10308 | 从 Sprague Dawley 大鼠脑组织中分离，第1代冻存并冷冻运输 |
| 皮层星形胶质细胞 | Innoprot | P10202 | 从出生2天的大鼠脑组织中分离，第1代冻存并冷冻运输 |
| 内皮细胞培养基试剂盒 | Innoprot | P60104 | ECM（500 ml）、胎牛血清（25 ml）、内皮细胞生长添加剂（5 ml）和青霉素/链霉素（5 ml）。使用前在37 °C水浴中预热，并避光保存 |
| 无酚红胰蛋白酶-EDTA | EuroClone | ECM0920D | 使用前在37 °C水浴中预热 |
| 异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖 40000 | Sigma | FD40S | 避光保存 |
| 不含钙和镁的杜氏磷酸盐缓冲液 | EuroClone | ECB4004L | |
| 曲拉通 X-100 | Sigma | T8787 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma | A7906 | |
| 山羊血清 | EuroClone | ECS0200D | |
| 聚-L-赖氨酸氢溴酸盐 | Sigma | P1274 | 同一溶液可多次使用 |
| 牛血浆来源的纤连蛋白 | Sigma | F1141 | 同一溶液可多次使用 |
| 聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）小室插件 | Falcon | F3090 | 透明聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）膜；表面积：4.2 cm²；孔径：0.4 µm/表面积 |
| T75 Primo TC 培养瓶 | EuroClone | ET7076 | |
| T175 Primo TC 培养瓶 | EuroClone | ET7181 | |
| EVOM2 上皮组织电压/电阻计 | World Precision Instruments Germany | EVOM2 | |
| Endohm-24SNAP 测量杯 | World Precision Instruments Germany | ENDOHM-24SNAP | |
| 带相机的明场/荧光显微镜 | Leica Microsystems | DM IL LED Fluo/ ICC50 W Camera Module | 用于活细胞观察的倒置显微镜，配备相机 |
| 共聚焦显微镜 | Leica Microsystems | TCS SPE |
