测量大鼠大脑不同亚细胞区室中的蛋白酶体活性

1. 蛋白酶体活性检测

注意:可以使用略微修改的 20S 蛋白酶体活性试剂盒在匀浆脑组织中测量蛋白酶体活性。该测定不直接测量完整的 26S 蛋白酶体复合物的活性。相反，它测量 20S 核心的活性，这意味着它只能作为了解核心本身活性的代理，而不是整个 26S 蛋白酶体复合物的活性。该测定的成功率会随着反复冻融循环和/或去污剂（尤其是离子）水平的增加而下降，并且需要使用具有 360/460（激发/发射）滤光片组和高达 37 °C 加热能力的读板器。

1. 酶标仪设置:预热至 37 °C 并保持整个运行过程。​
   1. 将 激发 设置为 360 度，将 发射 设置为 460。如果使用的 96 孔板是透明的，请将光学元件位置设置为 Bottom。如果使用深色/黑色 96 孔板，请将光学元件位置设置为顶部。
   2. 在荧光读取选项下将较旧的读板器型号设置为 Auto-Gain;较新的型号已为此预设。以 2 小时的时间编程动力学运行，每 30 分钟扫描（读取）。
2. 用 13.5 mL 超纯水重构试剂盒中提供的 10x 检测缓冲液。将 14 μL 100 mM ATP 添加到现在的 1x 缓冲液中;这显着增强了样品中的蛋白酶体活性并提高了检测可靠性。最终的 20S 检测缓冲液可以储存在冰上或 4 °C 直至需要，并且可以稳定数月。
3. 用 100 μL DMSO 复溶试剂盒中提供的 AMC 标准品。在黑暗或弱光条件下执行此步骤，因为标准对光敏感。
4. 使用重构的标准品在黑暗或弱光条件下创建 AMC 的标准曲线。
   1. 在单独的 0.5 mL 微量离心管中，加入 16、8、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4 和 0 μL 的 AMC 标准品，对应于 20、10、8、4、2、1、0.5 和 0 μM AMC 浓度。
   2. 向这些试管中，按相同顺序添加 84、92、93.6、96.8、98.4、99.2、99.6 和 100 μL 20S 检测缓冲液。这会产生一系列从高到低的 AMC 浓度，这些浓度将用于酶标仪校准和均质样品中蛋白酶体活性的分析。
   3. 将所有稀释的标准品储存在冰上，在黑暗中，直到需要。
5. 用 65 μL DMSO 重构试剂盒中提供的蛋白酶体底物 （Suc-LLVY-AMC）。在黑暗或弱光条件下执行此步骤，因为基材对光敏感。使用 20S 检测缓冲液在新的 1.5 mL 微量离心管中制备蛋白酶体底物的 1:20 稀释液。将稀释的底物储存在黑暗中的冰上，直到需要><为止。 注意:例如，如果板有 10 个样品和 1 个空白样品，您将需要足够的稀释底物来容纳 22 个孔（有重复），每孔 10 μL。这相当于需要 220 μL + 30 μL 的移液误差，需要 12.5 μL 底物和 237.5 μL 20S 检测缓冲液。
6. 解冻所需的样品（如果冷冻）并向 96 孔板中加入标准化量。重复运行每个样品。所需的样品量因组织制备而异。通常，10-20 μg 对于任何亚细胞组分就足够了。
7. 用超纯水将样品孔体积调至 80 μL。添加量取决于添加的样品量。例如，如果样品 1 为 4.5 μL 蛋白质，样品 2 为 8.7 μL，则所需水量分别为 75.5 μL 和 71.3 μL。在两个单独的井中，单独加入 80 μL 水;这些将是 Assay Blanks.
   注意:为了限制由于移液错误引起的蛋白质体积变化，可以将蛋白质浓度标准化为浓度最低的样品。这将允许在所有条件下使用相同的样品体积。
8. 向每个孔中加入 10 μL 20S 检测缓冲液，包括检测空白。此处建议使用重复器/自动移液器，以确保跨孔的分析体积一致。
9. 可选:在此阶段，如果需要，引入体外作;这将要求每个样品每次处理（包括载体）有额外的 2 个孔。如果是这样，则向 2 个样品孔中加入 5-10 μL 感兴趣的药物/化合物，并向另外 2 个孔中加入等体积的对照/载体。将板放在预热的读板器上或放入 37 °C 培养箱中 30 分钟。
10. 关灯或进入黑暗的房间。将所有 100 μL 稀释的 AMC 标准品添加到新孔中;每个标准品都有一个孔。
11. 在黑暗中，将 10 μL 稀释的蛋白酶体底物添加到含有样品和检测空白的孔中，但不添加到 AMC 标准品中。此处建议使用重复器/自动移液器，以确保跨孔的分析体积一致。
12. 将板放入酶标仪中，然后开始动力学运行。
    注意:在动力学运行期间，板不需要处于持续搅拌状态，但是，用户可以根据需要选择
13. 动力学运行结束时，将原始 360/460 荧光值导出到 Microsoft Excel。
    1. 将每个标准品、每个样品和所有 5 次扫描的分析空白的重复孔取平均值。样品的原始荧光值在扫描过程中应增加，但标准品和检测空白的荧光值保持稳定（或略有下降）。
    2. 取最高 AMC 标准井平均值，除以已知浓度 （20 μM）。将该值除以分析中使用的样品浓度，以获得标准化的 AMC 值。对于每个样品和 Assay Blank 平均值，除以标准化 AMC 值。
    3. 取该最终值除以分析中使用的样品浓度，得到每个样品的标准化值和检测空白。对所有 5 次扫描执行此作。
    4. 从所有 5 次扫描的每个标准化样品值中减去标准化的 Assay Blank 值。