测量大鼠大脑不同亚细胞区室中的蛋白酶体活性

摘要

来源:McFadden， T. 等人 量化啮齿动物大脑中的亚细胞泛素-蛋白酶体活性。J. Vis. Exp. （2019 年）。

该视频演示了如何使用荧光肽测定法测量恐惧条件大鼠和对照大鼠大脑中杏仁核外侧亚细胞区室中蛋白酶体活性。蛋白酶体裂解荧光肽底物，释放荧光分子，使用酶标仪对其进行定量，以评估核和突触蛋白组分中的蛋白酶体活性。核活性增加表明基因表达发生变化，而突触活性降低表明长期记忆维持所需的蛋白质稳定。

方案

1. 蛋白酶体活性检测

注意:可以使用略微修改的 20S 蛋白酶体活性试剂盒在匀浆脑组织中测量蛋白酶体活性。该测定不直接测量完整的 26S 蛋白酶体复合物的活性。相反，它测量 20S 核心的活性，这意味着它只能作为了解核心本身活性的代理，而不是整个 26S 蛋白酶体复合物的活性。该测定的成功率会随着反复冻融循环和/或去污剂（尤其是离子）水平的增加而下降，并且需要使用具有 360/460（激发/发射）滤光片组和高达 37 °C 加热能力的读板器。

1. 酶标仪设置:预热至 37 °C 并保持整个运行过程。​
   1. 将 激发 设置为 360 度，将 发射 设置为 460。如果使用的 96 孔板是透明的，请将光学元件位置设置为 Bottom。如果使用深色/黑色 96 孔板，请将光学元件位置设置为顶部。
   2. 在荧光读取选项下将较旧的读板器型号设置为 Auto-Gain;较新的型号已为此预设。以 2 小时的时间编程动力学运行，每 30 分钟扫描（读取）。
2. 用 13.5 mL 超纯水重构试剂盒中提供的 10x 检测缓冲液。将 14 μL 100 mM ATP 添加到现在的 1x 缓冲液中....

材料