测量大鼠大脑不同亚细胞区室中的蛋白酶体活性

摘要

来源:McFadden， T. 等人 量化啮齿动物大脑中的亚细胞泛素-蛋白酶体活性。J. Vis. Exp. （2019 年）。

该视频演示了如何使用荧光肽测定法测量恐惧条件大鼠和对照大鼠大脑中杏仁核外侧亚细胞区室中蛋白酶体活性。蛋白酶体裂解荧光肽底物，释放荧光分子，使用酶标仪对其进行定量，以评估核和突触蛋白组分中的蛋白酶体活性。核活性增加表明基因表达发生变化，而突触活性降低表明长期记忆维持所需的蛋白质稳定。

方案

1. 蛋白酶体活性检测

注意:可以使用略微修改的 20S 蛋白酶体活性试剂盒在匀浆脑组织中测量蛋白酶体活性。该测定不直接测量完整的 26S 蛋白酶体复合物的活性。相反，它测量 20S 核心的活性，这意味着它只能作为了解核心本身活性的代理，而不是整个 26S 蛋白酶体复合物的活性。该测定的成功率会随着反复冻融循环和/或去污剂（尤其是离子）水平的增加而下降，并且需要使用具有 360/460（激发/发射）滤光片组和高达 37 °C 加热能力的读板器。

1. 酶标仪设置:预热至 37 °C 并保持整个运行过程。​
   1. 将 激发 设置为 360 度，将 发射 设置为 460。如果使用的 96 孔板是透明的，请将光学元件位置设置为 Bottom。如果使用深色/黑色 96 孔板，请将光学元件位置设置为顶部。
   2. 在荧光读取选项下将较旧的读板器型号设置为 Auto-Gain;较新的型号已为此预设。以 2 小时的时间编程动力学运行，每 30 分钟扫描（读取）。
2. 用 13.5 mL 超纯水重构试剂盒中提供的 10x 检测缓冲液。将 14 μL 100 mM ATP 添加到现在的 1x 缓冲液中;这显着增强了样品中的蛋白酶体活性并提高了检测可靠性。最终的 20S 检测缓冲液可以储存在冰上或 4 °C 直至需要，并且可以稳定数月。
3. 用 100 μL DMSO 复溶试剂盒中提供的 AMC 标准品。在黑暗或弱光条件下执行此步骤，因为标准对光敏感。
4. 使用重构的标准品在黑暗或弱光条件下创建 AMC 的标准曲线。
   1. 在单独的 0.5 mL 微量离心管中，加入 16、8、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4 和 0 μL 的 AMC 标准品，对应于 20、10、8、4、2、1、0.5 和 0 μM AMC 浓度。
   2. 向这些试管中，按相同顺序添加 84、92、93.6、96.8、98.4、99.2、99.6 和 100 μL 20S 检测缓冲液。这会产生一系列从高到低的 AMC 浓度，这些浓度将用于酶标仪校准和均质样品中蛋白酶体活性的分析。
   3. 将所有稀释的标准品储存在冰上，在黑暗中，直到需要。
5. 用 65 μL DMSO 重构试剂盒中提供的蛋白酶体底物 （Suc-LLVY-AMC）。在黑暗或弱光条件下执行此步骤，因为基材对光敏感。使用 20S 检测缓冲液在新的 1.5 mL 微量离心管中制备蛋白酶体底物的 1:20 稀释液。将稀释的底物储存在黑暗中的冰上，直到需要><为止。 注意:例如，如果板有 10 个样品和 1 个空白样品，您将需要足够的稀释底物来容纳 22 个孔（有重复），每孔 10 μL。这相当于需要 220 μL + 30 μL 的移液误差，需要 12.5 μL 底物和 237.5 μL 20S 检测缓冲液。
6. 解冻所需的样品（如果冷冻）并向 96 孔板中加入标准化量。重复运行每个样品。所需的样品量因组织制备而异。通常，10-20 μg 对于任何亚细胞组分就足够了。
7. 用超纯水将样品孔体积调至 80 μL。添加量取决于添加的样品量。例如，如果样品 1 为 4.5 μL 蛋白质，样品 2 为 8.7 μL，则所需水量分别为 75.5 μL 和 71.3 μL。在两个单独的井中，单独加入 80 μL 水;这些将是 Assay Blanks.
   注意:为了限制由于移液错误引起的蛋白质体积变化，可以将蛋白质浓度标准化为浓度最低的样品。这将允许在所有条件下使用相同的样品体积。
8. 向每个孔中加入 10 μL 20S 检测缓冲液，包括检测空白。此处建议使用重复器/自动移液器，以确保跨孔的分析体积一致。
9. 可选:在此阶段，如果需要，引入体外作;这将要求每个样品每次处理（包括载体）有额外的 2 个孔。如果是这样，则向 2 个样品孔中加入 5-10 μL 感兴趣的药物/化合物，并向另外 2 个孔中加入等体积的对照/载体。将板放在预热的读板器上或放入 37 °C 培养箱中 30 分钟。
10. 关灯或进入黑暗的房间。将所有 100 μL 稀释的 AMC 标准品添加到新孔中;每个标准品都有一个孔。
11. 在黑暗中，将 10 μL 稀释的蛋白酶体底物添加到含有样品和检测空白的孔中，但不添加到 AMC 标准品中。此处建议使用重复器/自动移液器，以确保跨孔的分析体积一致。
12. 将板放入酶标仪中，然后开始动力学运行。
    注意:在动力学运行期间，板不需要处于持续搅拌状态，但是，用户可以根据需要选择
13. 动力学运行结束时，将原始 360/460 荧光值导出到 Microsoft Excel。
    1. 将每个标准品、每个样品和所有 5 次扫描的分析空白的重复孔取平均值。样品的原始荧光值在扫描过程中应增加，但标准品和检测空白的荧光值保持稳定（或略有下降）。
    2. 取最高 AMC 标准井平均值，除以已知浓度 （20 μM）。将该值除以分析中使用的样品浓度，以获得标准化的 AMC 值。对于每个样品和 Assay Blank 平均值，除以标准化 AMC 值。
    3. 取该最终值除以分析中使用的样品浓度，得到每个样品的标准化值和检测空白。对所有 5 次扫描执行此作。
    4. 从所有 5 次扫描的每个标准化样品值中减去标准化的 Assay Blank 值。

材料