测量大鼠脑内不同亚细胞区室中的蛋白酶体活性

摘要

来源：McFadden, T.，等。定量分析啮齿类动物大脑中细胞亚结构的泛素-蛋白酶体活性。J. Vis. Exp. (2019)。

本视频演示了如何利用荧光肽底物检测法，测定恐惧条件化大鼠与对照组大鼠脑内侧杏仁核不同亚细胞区室中的蛋白酶体活性。蛋白酶体可切割荧光肽底物，释放出荧光分子，通过酶标仪定量荧光信号，从而评估核蛋白和突触蛋白组分中的蛋白酶体活性。核内活性升高提示基因表达发生变化，而突触活性降低则表明蛋白质稳定性增强，这对于长期记忆的维持至关重要。

方案

1. 蛋白酶体活性检测

注意：可使用稍作修改的20S蛋白酶体活性检测试剂盒来测定匀浆脑组织中的蛋白酶体活性。该检测方法不直接测量完整26S蛋白酶体复合物的活性，而是测量20S核心的活性，因此仅能作为了解20S核心自身活性的间接指标，而不能代表整个26S蛋白酶体复合物的活性。该检测的成功率会随着反复冻融循环和/或去垢剂（尤其是离子型去垢剂）浓度的增加而下降，且需要使用配备360/460（激发/发射）滤光片并具备加热至37 °C功能的酶标仪。

1. 酶标仪设置：预热至 37 °C，并在运行过程中保持该温度。​
   1. 设置激发波长为 360 nm，发射波长为 460 nm。若使用的 96 孔板为透明板，则将光学检测位置设为底部；若使用深色/黑色 96 孔板，则将光学检测位置设为顶部。
   2. 对于较老型号的酶标仪，在荧光读数选项中设置为自动增益；新型号仪器已预设此模式。设定动力学程序运行 2 小时，每 30 分钟扫描（读取）一次。
2. 用 13.5 mL 超纯水重悬试剂盒中提供的 10x 检测缓冲液。向现已稀释为 1x 的缓冲液中加入 14 µL 的 100 mM ATP；这能显著增强样品中蛋白酶体的活性，并提高检测的可靠性。最终的 20S 检测缓冲液可置于冰上或 4 °C 保存，直至使用，且在数月内保持稳定。
3. 用 100 µL DMSO 重悬试剂盒中提供的 AMC 标准品。此步骤应在避光或低光照条件下进行，因为该标准品对光敏感。
4. 使用重悬后的标准品在避光或低光照条件下制备 AMC 标准曲线。
   1. 在不同的 0.5 mL 微量离心管中，分别加入 16、8、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4 和 0 µL 的 AMC 标准品，对应 AMC 浓度分别为 20、10、8、4、2、1、0.5 和 0 µM。
   2. 按照相同顺序，向上述各管中分别加入 84、92、93.6、96.8、98.4、99.2、99.6 和 100 µL 的 20S 检测缓冲液。由此获得一系列从高到低的 AMC 浓度，用于酶标仪校准及对匀浆样品中蛋白酶体活性的分析。
   3. 将所有稀释后的标准品避光置于冰上，直至使用。
5. 用 65 µL DMSO 重悬试剂盒中提供的蛋白酶体底物（Suc-LLVY-AMC）。此步骤应在避光或低光照条件下进行，因为该底物对光敏感。使用 20S 检测缓冲液在新的 1.5 mL 微量离心管中对蛋白酶体底物进行 1:20 稀释。将稀释后的底物避光置于冰上，直至使用。
   注意：例如，若板中包含 10 个样品和 1 个空白，则需要足够用于 22 个孔（设重复）的稀释底物，每孔 10 µL。总计需 220 µL，另加 30 µL 以补偿移液误差，共需 250 µL。因此需取 12.5 µL 底物与 237.5 µL 20S 检测缓冲液混合。
6. 解冻所需样品（如为冷冻样品），并将等量化样品加入 96 孔板中。每个样品设两个重复孔。所需样品量取决于组织制备方式，通常对于任何亚细胞组分，10–20 µg 即可满足要求。
7. 用超纯水将各孔中样品体积补至 80 µL。所加水量取决于已加入的样品体积。例如，若样品 1 加入了 4.5 µL 蛋白，样品 2 加入了 8.7 µL，则所需加水量分别为 75.5 µL 和 71.3 µL。另取两个独立孔，每孔加入 80 µL 水，作为空白对照孔（Assay Blanks）。
   注意：为减少因移液误差导致的蛋白体积变化，可将蛋白浓度归一化至最低浓度样品，从而在所有条件下使用相同的样品体积。
8. 向每个孔（包括空白对照孔）加入 10 µL 的 20S 检测缓冲液。建议使用多通道移液器或自动移液器，以确保各孔中检测体积一致。
9. 可选步骤：在此阶段可根据需要引入体外干预处理；此时每个样品需为每种处理（包括溶剂对照）额外增加 2 个孔。若进行此操作，向两个样品孔中各加入 5–10 µL 待测药物/化合物，向另两个孔中加入等体积的对照/溶剂。将板置于预热的酶标仪中或 37 °C 培养箱中孵育 30 分钟。
10. 关闭灯光或进入暗室。将全部 100 µL 稀释后的 AMC 标准品分别加入新孔中，每种标准品使用一个单独的孔。
11. 在暗处向含样品及空白对照孔中加入 10 µL 稀释后的蛋白酶体底物，但不加入 AMC 标准品孔中。建议使用多通道移液器或自动移液器，以确保各孔检测体积一致。
12. 将板放入酶标仪中并启动动力学程序。
    注意：动力学运行期间，板无需持续振荡，但用户可根据需要选择是否振荡。
13. 动力学程序结束后，将原始的 360/460 荧光值导出至 Microsoft Excel。
    1. 对每个标准品、每个样品及空白对照的 5 次扫描数据中的重复孔取平均值。样品的原始荧光值应随扫描次数增加而上升，而标准品和空白对照的荧光值应保持稳定或略有下降。
    2. 取最高浓度 AMC 标准品孔的平均荧光值，除以其已知浓度（20 µM），得到单位浓度荧光值。再将该值除以检测中所用的样品浓度，获得标准化的 AMC 值。对每个样品及空白对照的平均荧光值，均除以该标准化 AMC 值。
    3. 将所得结果再除以检测中所用的样品浓度，得到每个样品及空白对照的归一化值。对全部 5 次扫描均进行此计算。
    4. 从每个归一化样品值中减去归一化空白对照值，对全部 5 次扫描均进行此操作。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
20S 蛋白酶体活性检测试剂盒	Millipore Sigma	APT280	其他供应商提供不同版本
ATP	Fisher	FERR1441	多种其他供应商
BioTek Synergy H1 酶标仪	BioTek	VATECHH1MT3	其他供应商提供不同版本
蛋白酶抑制剂	Millipore Sigma	P8340	多种其他供应商
DMSO	DMSO	D8418	多种其他供应商