测量大鼠脑内不同亚细胞区室中的蛋白酶体活性

摘要

来源：McFadden, T.，等。定量分析啮齿类动物大脑中细胞亚结构的泛素-蛋白酶体活性。J. Vis. Exp. (2019)。

本视频演示了如何利用荧光肽底物检测法，测定恐惧条件化大鼠与对照组大鼠脑内侧杏仁核不同亚细胞区室中的蛋白酶体活性。蛋白酶体可切割荧光肽底物，释放出荧光分子，通过酶标仪定量荧光信号，从而评估核蛋白和突触蛋白组分中的蛋白酶体活性。核内活性升高提示基因表达发生变化，而突触活性降低则表明蛋白质稳定性增强，这对于长期记忆的维持至关重要。

方案

1. 蛋白酶体活性检测

注意：可使用稍作修改的20S蛋白酶体活性检测试剂盒来测定匀浆脑组织中的蛋白酶体活性。该检测方法不直接测量完整26S蛋白酶体复合物的活性，而是测量20S核心的活性，因此仅能作为了解20S核心自身活性的间接指标，而不能代表整个26S蛋白酶体复合物的活性。该检测的成功率会随着反复冻融循环和/或去垢剂（尤其是离子型去垢剂）浓度的增加而下降，且需要使用配备360/460（激发/发射）滤光片并具备加热至37 °C功能的酶标仪。

1. 酶标仪设置：预热至 37 °C，并在运行过程中保持该温度。​
   1. 设置激发波长为 360 nm，发射波长为 460 nm。若使用的 96 孔板为透明板，则将光学检测位置设为底部；若使用深色/黑色 96 孔板，则将光学检测位置设为顶部。
   2. 对于较老型号的酶标仪，在荧光读数选项中设置为自动增益；新型号仪器已预设此模式。设定动力学程序运行 2 小时，每 30 分钟扫描（读取）一次。
2. 用 13.5 mL 超纯水重悬试剂盒中提供的 10x 检测缓冲液。向现已稀释为 1x 的缓冲液中加入 14 µL 的 100 mM ATP；这能....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
20S 蛋白酶体活性检测试剂盒	Millipore Sigma	APT280	其他供应商提供不同版本
ATP	Fisher	FERR1441	多种其他供应商
BioTek Synergy H1 酶标仪	BioTek	VATECHH1MT3	其他供应商提供不同版本
蛋白酶抑制剂	Millipore Sigma	P8340	多种其他供应商
DMSO	DMSO	D8418	多种其他供应商