从小鼠缺血性脑组织获取细胞悬液

摘要

来源：Pösel, C.，等。小鼠缺血性脑组织中免疫细胞的分离与流式细胞术分析。J. Vis. Exp. (2016)

本视频演示了通过酶消化法从小鼠缺血脑组织中分离脑细胞和浸润的免疫细胞的实验步骤，随后利用密度梯度离心去除细胞碎片和髓鞘，以用于脑卒中研究中的炎症反应分析。

方案

所有涉及动物样本的实验程序均已通过相应的动物伦理审查委员会的审查和批准。

1. 试剂的准备

1. 消化缓冲液（每半脑1 ml）：溶解含有纯化消化酶的标准化混合物， 例如， 低热解酶浓度的Liberase（TL），用含钙（Ca）和镁（Mg）的Hanks平衡盐溶液（HBSS）配制至浓度为2 U/ml。
2. 含DNA酶的洗涤缓冲液：将DNA酶I溶解于不含钙/镁（Ca/Mg）的HBSS中，终浓度为666 U/ml，并加入10%胎牛血清（FCS）。
3. 不含DNA酶的洗涤缓冲液：含10% FCS的HBSS（无Ca/Mg）。
4. 密度梯度介质（每半脑5 ml）：通过将九份密度梯度介质与一份1.5 M氯化钠混合，配制等渗密度梯度介质原液（SIP；100%）。取适量SIP，加入含3%胎牛血清（FCS）的HBSS（无钙镁），稀释至25%密度。

2. 将脑组织解离为单细胞悬液

1. 用干净的剃须刀片小心去除脑干和小脑。使用干净的剃须刀片将脑组织沿中线切开分为左右两半，并将每侧半球沿冠状面切成大小大致相等的三块。
2. 使用5 ml注射器的推杆端，将每侧半脑的解剖组织通过100 µm细胞滤筛进行研磨。持续用冰浴的HBSS（+Ca/Mg）冲洗细胞滤筛。将匀浆后的样品置于冰上保存。
3. 在286 × g、4 °C条件下离心5分钟，小心弃去上清液。将沉淀物重悬于1 ml消化缓冲液中，并将悬液转移至2 ml离心管中。在37 °C下缓慢持续旋转孵育1小时。
4. 将细胞悬液通过70 µm细胞滤筛过滤，并用含DNA酶的3 ml洗涤缓冲液充分冲洗，随后用15 ml不含DNA酶的洗涤缓冲液冲洗。在286 × g、18 °C条件下离心5分钟，弃去上清液。注意： 使用DNA酶可消除细胞裂解产生的DNA黏液，防止细胞聚集，从而提高细胞存活率。

3. 去除髓鞘和细胞碎片的密度梯度离心法

1. 将细胞沉淀重悬于 5 ml 的 25% 密度梯度培养基中，并用移液器将悬液转移至 15 ml 离心管中。通过反复轻柔吹打充分混匀，避免产生气泡。注意：密度梯度培养基应在室温下使用，以防止细胞聚集。
2. 在 521 × g、18 °C 条件下离心 20 分钟。使用转子的最低加速度档位，并让转子自然停止，不使用刹车。从离心机中取出离心管时动作要轻柔，避免振荡。小心吸除上清液及表面的髓鞘层，同时保留管底的细胞沉淀。注意：务必彻底清除全部髓鞘层，残留物将影响流式细胞术分析结果。
3. 将沉淀用 10 ml 无 DNase 的洗涤缓冲液重悬，并将悬液转移至新的 15 ml 离心管中。注意：此洗涤步骤至关重要，充分去除密度梯度培养基可显著提高最终细胞样本的数量和质量。
4. 再次在 286 × g、10 °C 条件下离心 5 分钟，弃去上清液。将细胞重悬于 100 µl 冷洗涤缓冲液中，使用血细胞计数板通过台盼蓝排斥法测定细胞数量和活力。将样本置于 4 °C 保存，并尽快进行后续处理。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
MACSmix 试管旋转仪	Miltenyi Biotec GmbH
Heraeus Multifuge 3SR+	Thermo Scientific
Hank's 平衡盐溶液 (HBSS)	Gibco/Life Technologies GmbH	14175-129
含钙/镁的 HBSS	Gibco/Life Technologies GmbH	24020-091
Liberase TL	Roche Diagnostics GmbH	5401020001	在室温下使用
Percoll Plus	GE Healthcare Europe GmbH	17-5445-01
胎牛血清	PAN Biotech	3302-P101003
台盼蓝	Gibco/Life Technologies GmbH	15250-061
Trucount	BD Biosciences	340334
磷酸盐缓冲液	Biochrom AG	L 182-10
DNase I	Roche Diagnostics GmbH	11284932001
硅胶管，1米	World precision instruments	503022
精细虹膜剪刀（尖/钝）	Fine Science Tools	14028-10
直头 1×2 齿镊子	Fine Science Tools	11021-14
钝头镊子	Fine Science Tools	11008-13
5 ml 注射器推杆	Carl Roth GmbH (Braun)	EP96.1
细胞筛，100 µm	Dr. I. Schubert, BD	2360-00
Omnican Fine 剂量注射器 1 mL	Braun	TBD
细胞筛，70 µm	Greiner Bio-One GmbH	542 070
移液管，10 ml	Greiner Bio-One GmbH	607180
移液管，10 ml	Sarstedt AG&Co	86,12,54,025
移液管，25 ml	Greiner Bio-One GmbH	760180
移液管，5 ml	Greiner Bio-One GmbH	606180
移液管，25 ml	Sarstedt AG&Co	86,16,85,020
移液管，5 ml	Sarstedt AG&Co	86,12,53,025
吸头，0.1–10 µl	Corning B.V. Life Sciences	4840
吸头，100–1000 µl	Greiner Bio-One GmbH	740290
吸头，10–200 µl	Greiner Bio-One GmbH	739296
反应管，1.5 ml	Greiner Bio-One GmbH	616201
反应管，2 ml	Greiner Bio-One GmbH	623201
细菌培养皿，94×16 mm	Greiner Bio-One GmbH	633180
Falcon 15 ml	Greiner Bio-One GmbH	188271
Falcon 50 ml	VWR International GmbH (BD)	734-0448
Neubauer 血细胞计数板	Biochrom AG	PDHC-N01
剃刀刀片	Carl Roth GmbH	CK07.1