从缺血小鼠脑组织获取细胞悬液

摘要

来源:Pösel， C. 等人。缺血小鼠大脑免疫细胞的分离和流式细胞术分析。J. Vis. Exp.（2016 年）

该视频演示了通过酶消化从缺血小鼠脑组织中分离脑细胞和浸润免疫细胞，然后通过密度梯度离心去除细胞碎片和髓鞘，以研究中风研究中的炎症反应的程序。

方案

所有涉及动物样本的程序均已经过适当的动物伦理审查和批准。

1. 试剂的制备

1. 消化缓冲液（每个半球 1 ml）:在含有钙 （Ca） 和镁 （Mg） 的汉克斯平衡盐溶液 （HBSS） 中溶解纯化消化酶的标准化混合物，例如具有低嗜热溶菌蛋白酶浓度 （TL） 的 Liberase，浓度为 2U/ml。
2. 含 DNAse 的洗涤缓冲液:将 DNAse I 溶解在含有 10% 胎牛血清 （FCS） 的 HBSS（不含 Ca/Mg（钙/镁））中，浓度为 666U/ml。
3. 不含 DNAse 的洗涤缓冲液:含有 10% FCS 的 HBSS（不含 Ca/Mg）。
4. 密度梯度培养基（每个半球 5 mL）:通过将 9 份密度梯度培养基与 1 份 1.5 M 氯化钠混合，制备储备等渗密度梯度培养基 （SIP;100%）。通过添加适当体积的含有 3% FCS 的 HBSS（不含 Ca/Mg），将 SIP 稀释至 25% 密度。

2. 脑组织解离成单细胞悬液

1. 用干净的剃须刀片小心地去除脑干和小脑。使用干净的剃须刀片将大脑半切成半球，沿冠状平面将每个半球切成三块大小大致相等的碎片。
2. 使用 5 ml 注射器的柱塞端，通过 100 μm 细胞过滤器切碎每个半球的组织。用冰冷的 HBSS （+Ca/Mg） 不断冲洗细胞过滤器。将均质化样品储存在冰上。
3. 在 286 x g 和 4°C 下离心 5 分钟，小心弃去上清液。将沉淀重悬于 1 ml 消化缓冲液中，并将悬浮液转移到 2 ml 管中。将悬浮液在 37 °C 下缓慢连续旋转孵育 1 小时。
4. 通过 70 μm 细胞过滤器筛分细胞悬液，并用 3 ml 含有 DNAse 的洗涤缓冲液彻底冲洗，然后用 15 ml 不含 DNAse 的洗涤缓冲液彻底冲洗。在 286 x g 和 18 °C 下离心 5 分钟，弃去上清液。注意:使用 DNAse 可以消除细胞裂解引起的 DNA 粘液，这可能会导致细胞聚集，从而影响细胞存活。

3. 用于去除髓鞘和细胞碎片的密度梯度离心

1. 将细胞沉淀重悬于 5 ml 25% 密度梯度培养基中，并将悬浮液移液至 15 ml 试管中。通过重复和轻柔的移液充分混合，避免形成气泡。注意:应在 RT 下使用密度梯度培养基以防止细胞聚集。
2. 在 521 x g 和 18 °C 下离心 20 分钟。使用转子的最低加速度曲线，并允许转子在没有制动器的情况下停止。轻轻地从离心机中取出试管，不要摇晃。小心吸出髓鞘外套和上清液，同时将细胞沉淀保留在试管底部。注意:确保去除整个髓鞘外套，因为任何残留物都会影响流式细胞术分析。
将
3. 沉淀重悬于 10 ml 不含 DNA 酶的洗涤缓冲液中，并将悬浮液移液到新的 15 ml 试管中。注意: 该洗涤步骤至关重要，因为充分去除密度梯度培养基对最终细胞样品的数量和质量有显著影响。
4. 再次以 286 x g 和 10 °C 离心 5 分钟，然后弃去上清液。将细胞重悬于 100 μl 冷洗涤缓冲液中，并通过血细胞计数器中的台盼蓝排除法测定细胞计数和活力。将样品储存在 4 °C 并进一步快速处理。

材料