帕金森病大鼠模型中左旋多巴诱导异动症的建立

摘要

来源：Caulfield, M. E., 等 帕金森病大鼠模型中左旋多巴诱导的运动障碍的诱导与评估。J. Vis. Exp. (2021)。

本视频展示了通过给予左旋多巴联合多巴胺转化抑制剂，在帕金森病大鼠模型中诱导左旋多巴诱导性运动障碍的过程。反复注射会过度刺激脑神经元，导致运动功能障碍。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 试剂与耗材的准备

1. 确定左旋-3,4-二羟基苯丙氨酸甲酯盐酸盐（左旋多巴或 L-DOPA）和盐酸苯丝肼（一种外周脱羧酶抑制剂，请参见材料表）的剂量、评估频率以及适合研究问题的实验时间线（图1）。
   注意：研究问题可涉及多种答案，范围包括特定疗法是否可能减轻已存在的左旋多巴诱导的运动障碍（LID），到预防LID的发生。还可探讨治疗效果是否依赖于左旋多巴的剂量，或LID的表达和/或治疗效果是否因受试动物的性别、物种和年龄而异。
2. 每周称量大鼠体重，根据研究期间持续的体重变化计算合适的药物用量。
   注意：由于LID阳性大鼠活动增加，长期使用左旋多巴治疗可能导致体重下降。若出现体重减轻，在注射左旋多巴后可给予营养全面且适口性高的零食（请参见材料表）。
3. 计算每周所需左旋多巴和苯丝肼的用量，按每日注射量称取冻干粉剂，混合后置于玻璃棕色瓶中，在-20 °C保存1–2周，直至给药当日使用。
   注意：目标剂量为12 mg/kg，即每1000 g体重给予12 mg左旋多巴。补充信息中提供了示例，说明如何根据12 mg左旋多巴/kg体重、注射体积为1 cc/kg大鼠体重的条件，计算每周每日所需左旋多巴和生理盐水的用量。

2. 房间与笼具设置

1. 在6-羟基多巴胺（6-OHDA）损毁手术后3-4周开始左旋多巴（L-DOPA）治疗的第一天，将大鼠转移至单笼饲养，并提供经IACUC批准的环境丰富化物品。
2. 在整个研究期间维持单笼饲养，以避免同笼动物对行为学评估造成干扰。
3. 在LID评分日，将大鼠的饲养笼放置于钢丝架上，倾斜约45°角，以便最佳观察大鼠行为（图2A）。将笼上的标识标签翻转至向上位置（图2B），并移除饮水瓶、食槽以及笼内所有类型的丰富化物品（图2C），以避免干扰行为学评估。

3. 左旋多巴注射与运动障碍评分

1. 左旋多巴皮下注射
   1. 在每日注射左旋多巴前，立即向已预先称重的冻干左旋多巴与苄丝肼混合物（置于棕色瓶中）加入适量无菌生理盐水，并充分振荡10秒（步骤1.3）。
      ​注意：目标注射剂量为每1000克体重1 mL（每毫升含12 mg左旋多巴）。所需无菌生理盐水体积取决于每项研究中的动物数量。
   2. 使用一次性注射器（例如1.0或0.5 mL，配备26 G针头）抽取每只动物所需剂量（1 mL/kg体重），并为每支注射器标注对应动物的编号。
      注意：填充后的注射器应置于无菌袋中避光保存，直至注射时使用。左旋多巴在水溶液环境中遇氧气和光照会迅速氧化。
   3. 将第一笼大鼠移至注射操作台旁。
   4. 将大鼠从笼中取出，放置于注射操作台面上。
   5. 用非优势手手掌轻轻固定大鼠头部和肩部，使其紧贴操作台面。
   6. 用非优势手拇指和食指轻轻提起大鼠肩胛区背部皮肤，形成皮下注射空间；然后用优势手持注射器，将左旋多巴溶液注入手指之间或下方的皮下组织，进针方向尽可能与身体平行，以避免刺入肌肉。
      ​注意：注射前大鼠不进行麻醉。
   7. 每支使用过的注射器应立即丢弃至锐器盒中。
   8. 将大鼠放回其单独的笼具中，并在非LID评分日提供营养全面的零食，以避免干扰行为学评估；在完成评分前不得给予零食。
   9. 根据评分需求及评分日的大鼠数量，设定1–2分钟的计时器。当计时器提示时，取出下一笼大鼠并进行注射。
   10. 重复上述操作，每隔1–2分钟注射一只大鼠，直至所有大鼠完成注射。
2. 左旋多巴诱导的运动障碍（LID）注射后评分
   1. 在预定的多个时间点对肌张力障碍和过度运动型运动障碍的强度（表1）和频率（表2）进行评分，时间点应包括LID行为的初始出现、峰值表现以及行为消退阶段。
   2. 对于成年雄性和雌性Sprague Dawley或Fisher 344大鼠，当样本量为N = 40只时，建议在首次左旋多巴注射后20分钟开始运动障碍评分，之后每隔50分钟评分一次，持续至注射后220或270分钟，具体结束时间取决于90%–100%大鼠的LID行为是否已完全停止。
   3. 若采用1分钟评分间隔，设置1分钟计时器。对第一只大鼠进行1分钟行为观察与评分，随后依次对下一只大鼠进行1分钟评分，直至完成所有大鼠的评分循环。
   4. 将计时器置于笼具旁显眼位置，以便在评分期间能够同时观察LID行为的强度（表1）并估算特定行为的发生频率（表2）。
   5. 完成第一个时间点的评分后，从第一只大鼠开始进入下一个时间点（例如注射后70分钟），按预定间隔（例如每50分钟）继续评分，直至所有时间点完成。
      注意：由于左旋多巴注射与LID评分任务存在时间重叠，评分日需配备两名人员，一人负责注射，另一人负责行为学评分。

结果

图 1：治疗时间线示例。 一个为期共 12 周的左旋多巴（L-DOPA）剂量递增治疗时间线示例，其中在 6-OHDA 损毁后第 3 周开始左旋多巴注射，持续 8 周，随后进行 4 周的实验性治疗。在此示例中，左旋多巴每周皮下注射 5 次（周一至周五），每天大致相同时间给药，每种规定剂量（3、6、9 和 12 mg/kg）均持续 2 周。在每个左旋多巴剂量水平的第 1、6 和 10 天进行行为学 LID 评分。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100 分钟数字计时器	Staples	1111764
Compass CX 紧凑型天平	Ohaus	30428202
5-(2-氨基乙基)-1,2,4-苯三酚单氢溴酸盐	Cayman Chemicals	25330	6-OHDA 是一种儿茶酚胺能神经毒素，用于在啮齿类动物中诱导多巴胺能损伤和帕金森样症状。
Allentown 大鼠笼具	Allentown, LLC	Rat900	Allentown 笼具可从各个方向观察大鼠。
BD 过敏科托盘，带永久性针头	BD	BD 305540	用于皮下注射 L-DOPA
盐酸苄丝肼	Sigma-Aldrich	B7283	苄丝肼是一种外周脱羧酶抑制剂，与 L-DOPA 联用，用于在帕金森病啮齿类模型中诱导运动障碍。
琥珀色玻璃闪烁小瓶	Thermo Scientific	B7921	用于在 -20 °C 下储存 L-DOPA/苄丝肼，直至与无菌生理盐水混合。
盐酸 L-3,4-二羟基苯丙氨酸甲酯	Sigma-Aldrich	D1507	L-3,4-二羟基苯丙氨酸甲酯是 L-DOPA 的前体物质，可穿过血脑屏障，用于治疗啮齿类动物的帕金森样症状。
Paper Mate Sharpwriter 机械铅笔	Staples	107250
啮齿类动物营养全面的强化零食	Bio-Serv	F05478
带盖圆形冰桶，2.5 L	Corning	432129
标准塑料文件夹板	Staples	1227770
钢丝制 6 英尺长可移动货架单元	Uline	H9488	宽度/高度可根据实验所需或每组大鼠数量进行调节
无菌生理盐水 0.9%	Covidien/Argyle	1020	用于与 L-DOPA/苄丝肼混合