皮质类器官切片中神经元衰老的检测

摘要

来源：Shaker, M. R.，等。用于体外建模大脑神经元衰老的皮质脑类器官的稳健且高度可重复的生成方法。J. Vis. Exp. (2022)。

本视频展示了通过染色β-半乳糖苷酶活性来检测皮层类器官切片中衰老神经元的方法，该酶在衰老细胞中表达升高。该酶可切割底物生成蓝色产物，随后通过显微镜观察染色的神经元。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 大脑类器官中神经元衰老的表征

1. 处理皮质类器官以制备冷冻切片：
   注意： 所有步骤均在二级生物安全柜中进行。
   1. 准备2 mL离心管，每管加入1.5 mL的4%多聚甲醛（PFA）。
   2. 剪切P1000移液器吸头的尖端（使其成为宽口吸头），并轻柔地将每个类器官转移至上述准备好的2 mL离心管中（每管一个类器官）。
      注意： 为防止过多的分化培养基（DM）与PFA混合，应让类器官沉降至P1000移液器吸头开口处，并将吸头末端轻轻置于管中PFA液面上方，再将类器官移出。这样可确保仅转移类器官及其极少量培养基。
   3. 在4°C条件下固定1小时。
   4. 使用未剪切的P1000移液器吸头，小心吸除多余的PFA，并加入1.5 mL冷的1×PBS（磷酸盐缓冲液）。
   5. 将离心管置于摇床上，设置转速为70 rpm，在室温（RT）下振荡洗涤10分钟。
   6. 用冷的1×PBS重复洗涤三次，以确保彻底去除所有PFA。
      注意： 不得将PFA排入普通废液容器中；应准备专用的化学废液收集容器，因为PFA具有危害性。
   7. 将类器官浸入含30%蔗糖的1×PBS中，并在4°C下孵育，直至所有类器官沉降至管底。
      注意： 类器官下沉所需时间取决于其大小和培养时间。三个月龄的类器官可能需要长达5小时。
   8. 使用剪切过的宽口P1000移液器吸头，轻柔地将三至五个类器官转移至包埋模具中，模具内含有由30%蔗糖与100%最佳切割温度（OCT）包埋剂按3:2比例配制的包埋液。
   9. 借助体视显微镜，使用10 µL移液器吸头将类器官排列成网格状并进行定位。
   10. 将模具置于干冰上，使蔗糖-OCT溶液凝固后，再使用冷冻切片机进行冷冻切片（厚度16–20 µm）。
       注意： 对于衰老相关β-半乳糖苷酶检测，所有组织必须在沉底后立即进行切片处理。对于免疫荧光染色，可在次日进行切片。若不能立即染色，所有载玻片上的切片必须在-20 °C下保存，以备后续进行免疫荧光或β-半乳糖苷酶染色。
2. 皮质脑类器官衰老分析的处理步骤：
   注意： 以下步骤可在普通实验台面上进行。
   1. 将载玻片放入带盖的显微镜载片染色缸中，用1×PBS在室温下洗涤三次，每次10分钟，以去除残留的包埋液。
   2. 随后，将洗涤后的组织与新配制的β-半乳糖苷酶染色液在37 °C下避光孵育过夜。
      注意： β-半乳糖苷酶染色液的配制如下（以10 mL磷酸盐缓冲液为例）：8.15 mL 1 M NaH₂PO₄，1.85 mL 1 M Na₂HPO₄，调节pH至6.0，加入100 mM铁氰化钾（III）、100 mM亚铁氰化钾（II）三水合物、5 M NaCl、1 M MgCl₂、20 mg/mL X-Gal。避免使用含CO₂的标准细胞培养箱，因为CO₂会改变β-半乳糖苷酶染色液的pH值。
   3. 用1×PBS在室温下洗涤染色后的组织三次，每次10分钟，以去除β-半乳糖苷酶染色液。
   4. 使用抗荧光淬灭封片剂将洗涤后的组织封片，并在室温下静置30分钟，使封片剂完全凝固，随后可在显微镜下观察。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
16% 甲醛（W/V），无甲醇	Thermo Fisher Scientific	28908	将 4% 多聚甲醛（PFA）溶于 1× PBS 中稀释
CKX53 显微镜配 SC50 相机	Olympus
杜尔贝科磷酸盐缓冲液（Dulbecco's Phosphate Buffered Saline）	Sigma Aldrich Pty Ltd	D1408-500ML
Neurobasal 培养基	Thermo Fisher Scientific	21103049	用于 DM 培养基中
OCT 包埋剂 Sakura Clear（118 mL/瓶）	Tissue Tek	4583
六氰合铁(II)酸钾三水合物	Sigma Aldrich Pty Ltd	CP1087
六氰合铁(III)酸钾	Sigma Aldrich Pty Ltd	455946
Prolong Glass 抗荧光淬灭封片剂	Life Technologies Australia (TFS)	P36980
蔗糖	Sigma Aldrich Pty Ltd	PHR1001-1G	将 30% 蔗糖溶于 1× PBS 中稀释