小鼠模型中的操作诱发性癫痫发作

摘要

来源：Batot, G.，等。利用鼠类脑脊髓炎病毒建立感染性病因癫痫模型。J. Vis. Exp. (2022)。

本视频展示了在感染赛勒病毒（Theiler's Murine Encephalomyelitis Virus, TMEV）的小鼠中诱导由操作引发的癫痫发作。感染后的小鼠神经元处于过度兴奋状态，当其受到外界物理刺激时，会引发应激反应，导致神经元出现异常电活动，进而诱发癫痫发作。

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 病毒接种

1. 注射器的灭菌
   1. 取下胰岛素注射器的针帽。在针头周围加装聚乙烯管作为套环，以确保2.5 mm的适当注射深度。将注射器浸入乙醇中30分钟。随后将注射器置于紫外线下照射30分钟。
   2. 将针帽重新盖回针头。用灭菌袋包裹注射器并用胶带封口。标注制备日期。
2. 病毒注射
   1. 从−80 °C冰箱中取出Daniel株TMEV的分装样品。将病毒解冻并置于冰上保存。避免反复冻融病毒。用病毒悬液（3 × 10⁵斑块形成单位[PFU]溶于20 µL磷酸盐缓冲液[PBS]或DMEM培养基）装填注射器。
      注意：该病毒对小鼠具有感染性，但对人类无感染性。
   2. 使用消毒剂清洁实验台面，并在通风橱内操作。病毒接种无需无菌操作，但应尽可能保持清洁。
   3. 将小鼠转移至麻醉诱导舱中，使用2%异氟烷与氧气混合气体进行麻醉诱导。达到手术麻醉深度需数分钟；根据动物的呼吸频率和麻醉深度调整浓度。
   4. 将麻醉后的小鼠从诱导舱转移至生物安全柜下。通过脚趾夹捏等方式检查手术麻醉深度。整个操作过程应在30秒内完成，因此注射期间动物无需持续吸入异氟烷。涂抹眼膏以防止角膜干燥。
   5. 使用酒精棉片清洁动物头部。将小鼠头部轻微向左倾斜，使注射部位朝上。
   6. 向后轻拉皮肤，将针头插入头部，在右半球颞区（右眼后方及内侧）以2.5 mm深度向大脑皮层内注射20 µL病毒液。
   7. 在所有动物中均单侧同一半球进行注射。以眼睛和耳朵作为顶叶皮层位置的解剖标志。此前已通过组织学方法验证注射位点准确性；见图1。相对于前囟的立体定位注射坐标为：−2.0（前后轴，AP）；+3.0（内外轴，ML）；−1.5（背腹轴，DV）。
   8. 注射后保持注射器静置5–15秒。记录是否有液体渗漏或气泡出现——若存在此类情况，需准备新的注射器。拔出注射器时应缓慢并轻微旋转。麻醉期间再次涂抹眼膏以防角膜干燥。
   9. 可选步骤：根据本地操作规程，在尾巴或耳朵上标记编码（动物处于无意识状态，操作简便，但非必需）。
   10. 将动物转移至新笼盒中，笼盒一半置于、一半离开加热垫（35–40 °C），以便其从麻醉中恢复。在动物恢复足够意识、能够维持胸卧位之前，不得无人看管。
       备注：恢复后可重新群养（感染动物不得与假感染动物混养）。感染小鼠不应与未感染小鼠饲养在同一房间内。
   11. 记录感染后前7天内小鼠的体重变化，因其在感染后可能出现体重下降，必要时需额外喂食。

2. 诱发性癫痫发作的监测

1. 由对处理分组不知情的实验人员执行本操作。将所有笼子移至工作台。在光照期每天观察动物两次，记录是否出现癫痫发作。
2. 采用改良的Racine评分标准对癫痫活动进行评分：0 = 行为无变化，1 = 口部和面部运动，2 = 点头动作，3 = 单侧前肢阵挛，4 = 双侧前肢阵挛并直立，5 = 全身性强直-阵挛发作并失去姿势控制，有时伴有跳跃，6 = 长时间且过度的跳跃和过度活动。记录癫痫发作的次数和强度。
3. 用笔在笼子表面滑动以制造声响。
4. 将每只动物转移到另一个盒子中，然后再放回原笼。
5. 用手前后轻轻摇晃笼子，注意不要剧烈摇晃，以免动物撞击笼壁或笼顶而造成身体伤害。
6. 监测笼内所有动物是否出现癫痫发作。一旦发现小鼠发生癫痫，立即将其转移回饲养笼，并记录癫痫等级，不再施加声音或操作刺激。
7. 对于未自发癫痫或经轻柔摇晃笼子后仍未癫痫的动物，可通过更强烈的操作诱发癫痫：小心抓住小鼠尾巴，将其从左向右翻转。
   注意： 癫痫动物处于高度兴奋状态，可能容易跳动。
8. 再次观察每只动物的癫痫行为表现。随后对其他笼子重复上述过程。

结果

图1：TMEV注射操作示意图。 从左至右：进行右侧顶叶皮层注射时，针头插入位置略偏离于同侧眼与对侧耳之间假想连线的外侧。用于控制深度的卡环以黄色标示。冠状脑切片中可见注射路径，由箭头指示。箭头上方所示坐标对应注射位点。右侧图像显示Theiler病毒（紫色）在海马结构CA1区的分布情况。该图使用biorender.com制作。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
动物天平	Ohaus (Parsippany, NJ, U.S.A.)	STX2202	0.01 g–2200 g
BD Lo-Dose U-100 胰岛素注射器	BD (Mississauga, ON, Canada)	BD329461	带永久性 BD Micro-Fine IV 针头的 Lo-Dose 无菌注射器 - 1 mL
TMEV Daniel 毒株	由 Robert Fujinami（犹他大学）惠赠	-	3 × 10⁵ 空斑形成单位分装液
消毒剂，例如 VennoVet 1 super	Menno Chemie Vertriebsgesellschaft GmbH, Germany	-	校园兽医推荐，酒精含量小于或等于 5%
Fisherbrand 中号无菌酒精棉片 C7	Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, U.S.A.)	22-363-750
Fluriso	VETone (Boise, ID, U.S.A)	502017	异氟烷 250 mL，2%–5%
废气吸收装置	Labconco (Kansas City, MO, U.S.A.)	-	-
通用防护一次性 SMS 白色实验服	Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, U.S.A.)	17-100-810A
冰桶	-	-	任意
小鼠笼具	-	-	可容纳至少 5 只小鼠的任意小鼠笼
PrecisionGlide 针头	BD (Mississauga, ON, Canada)	329652	BD Slip Tip 带 PrecisionGlide 针头的胰岛素注射器 - 26 G × 3/8 - 0.45 mm × 10 mm
自封式灭菌袋	Fisher Scientific (Hampton, NY, U.S.A.)	NC9241087	12.6 × 25.5 cm
小型玻璃烧瓶	-	-	任意，体积 25 mL
无菌 PBS	Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, U.S.A.)	10010056
注射器鲁尔锁头	BD (Mississauga, ON, Canada)	309628	仅 1 mL 注射器
超声波清洗机，带加热/机械定时器	Cole-Parmer (Vernon Hills, IL, U.S.A.)	EW-08895-23	水浴超声波清洗器 - 0.5 加仑，115 V