通过溶血磷脂酰胆碱两点注射建立局灶性脱髓鞘小鼠模型

摘要

来源：Pang, X., 等. 一种稳定建立的小鼠溶血磷脂酸胆碱诱导局灶性脱髓鞘两点注射模型. J. Vis. Exp. (2022)

本视频演示了使用两点溶血磷脂酰胆碱（LPC）注射法建立局灶性脱髓鞘小鼠模型的技术。首先暴露麻醉小鼠的颅骨，确定注射坐标后钻孔，以便在靶向位点进行LPC注射。LPC通过引发炎症反应导致神经元局灶性脱髓鞘，而两点注射可确保脱髓鞘效应的持续性。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 溶血磷脂酰胆碱（LPC）溶液的配制

1. 取25 mg LPC粉末（见材料表），加入250 µL氯仿与甲醇混合溶液（1:1），溶解配制成10%的LPC溶液，并转移至500 µL离心管中。
    注意：若LPC未完全溶解，可将离心管置于超声清洗器中，在40 kHz条件下超声处理约1小时，以获得均匀溶液。
2. 将溶液分装为每管3 µL，并于−80 °C保存。
    注意：该溶液可保存约2年。
3. 手术前，将溶液（步骤1.2）用27 µL 0.9%氯化钠（NaCl）溶液稀释，并置于37 °C恒温水浴中保温。
    ​注意：请在即将开始注射前配制该溶液。

2. 手术准备

1. 使用32 G、2英寸针头连接5 µL注射器（参见材料表）。确保微升注射器无堵塞。抽取5 µL LPC溶液以准备注射。
2. 将小鼠置于与异氟烷挥发器相连的诱导室中进行麻醉，使用3%异氟烷与100%氧气混合，流速约为0.3 L/min。
3. 通过夹捏脚趾无反射且呼吸平稳来确认麻醉深度。
4. 使用电动剃须刀剃除小鼠两耳之间的头部毛发。术中滴加润滑性眼药水，以防角膜干燥。
5. 随后将小鼠背侧朝上固定于立体定位仪（参见材料表）中，用鼻罩和门齿夹固定头部，并通过鼻部持续给予1.2%–1.6%异氟烷维持麻醉。
   注意：可根据小鼠的呼吸状态调整异氟烷浓度。

3. 手术步骤

注意：所有操作过程中，动物均置于加热垫上。

1. 使用双侧耳棒将小鼠固定在立体定位仪上。确保耳棒处于水平位置，头部保持水平且稳定。
2. 用碘伏以环形方式多次擦拭头部皮肤进行消毒，随后用酒精擦拭。然后使用手术刀沿头皮正中线切开约1.5 cm的小切口，以暴露颅骨。
3. 用浸有1%过氧化氢的棉签擦拭颅骨，直至暴露前囟（bregma）、后囟（lambda）和顶骨囟（posterior fontanelle）。将注射器安装在立体定位仪上。
    注意：使用过氧化氢时需小心，避免接触周围组织。
4. 确保动物头部处于水平位置（前后及左右方向均需水平）。
   1. 调节立体定位仪Z轴旋钮，使针尖与颅骨刚好接触而不发生弯曲，然后测量Z轴坐标。检测前囟和顶骨囟的Z坐标。
   2. 调节耳棒，使前囟与顶骨囟的Z坐标差值不超过0.02 mm。然后采用相同方法测量中线左右两侧对应位置的Z坐标，调节耳棒以确保左右两侧处于同一水平。
5. 定位胼胝体。以前囟（bregma）为XYZ坐标原点。
    注意：第一次注射位点位于前囟外侧1.0 mm、深度2.4 mm、前向1.1 mm；第二次注射位点位于前囟外侧1.0 mm、深度2.1 mm、前向0.6 mm。例如，若前囟坐标为(0,0,0)，测量标记位置(-1, 1.1, X)和(-1, 0.6, Y)的Z坐标，可确定胼胝体第一个注射位点坐标为(-1, 1.1, −[X + 2.4])，第二个注射位点为(-1, 0.6, −[Y + 2.1])。
6. 确定注射位点后，用无菌标记笔在颅骨上做标记，并记录坐标。
7. 使用颅骨钻（见材料表）轻轻钻开已标记的位点，注意避免出血。
8. 缓慢将针头移动至指定坐标并开始注射。为诱导胼胝体脱髓鞘，每个注射位点（步骤3.5）以0.4 µL/min的速度注射2 µL LPC溶液（步骤1.2）。
9. 注射完成后，将针头在每个位点保留额外10分钟。
    ​注意：确保两次注射之间的间隔不超过20分钟。
10. 使用4-0缝线缝合皮肤，并在10分钟内等待动物苏醒。根据机构动物护理规定，术后给予镇痛药物。
     注意：安乐死的推荐时间可根据实验目的确定。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
蛋黄来源的 L-α-溶血磷脂酰胆碱	Sigma-Aldrich	L4129-25MG
32 号针头	HAMILTON	7762-05
10 μl 注射器	HAMILTON	80014
高速颅骨钻	strong,korea	strong204
钻机	Hager & Meisinger, Germany	REF 500 104 001 001 005
Matrx 动物麻醉呼吸机	MIDMARK	VMR
小鼠用便携式立体定位仪	Reward	68507
微量注射器	Reward	KDS LEGATO 130
异氟烷	VETEASY
缝合线	FUSUNPHARMA	20152021225
成年 C57BL/6 雄性和雌性小鼠	Hunan SJA Laboratory Animal Co. Ltd