通过血红蛋白脑室内注射建立新生儿脑室内出血模型

摘要

来源：Miller, B. A., 等. 通过血红蛋白脑室内注射建立新生儿脑室内出血模型。J. Vis. Exp. (2022)。

本视频展示了一种建立新生大鼠脑室内出血模型的方法。在该操作中，向麻醉后的大鼠幼崽脑侧脑室注射血红蛋白。血红蛋白可引起氧化应激并释放血红素，从而模拟脑室内出血。由此产生的脑组织损伤由活性氧和炎性细胞因子介导，导致脑室扩大，这是脑室内出血的常见后果。

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 血红蛋白和脑脊液溶液的制备

1. 取500 µL人工脑脊液（aCSF）溶液加入1.5 mL微量离心管中，配制无菌人工脑脊液（aCSF）溶液，并置于冰上保存。
2. 在1.5 mL微量离心管中，将75 mg血红蛋白溶于500 µL aCSF中，配制无菌150 mg/mL血红蛋白溶液，并置于冰上保存。

2. 注射前动物的准备

1. 将加热垫调至中等温度，以维持大鼠的体温。
2. 将出生后第4天（P4）的大鼠置于充满3%异氟烷的诱导室中进行麻醉。
   注意：每15分钟通过脚趾/尾巴夹捏反应确认麻醉深度。通过观察组织颜色、体温和呼吸频率进行麻醉监测。
3. 对已麻醉的大鼠皮下注射5 mg/kg的卡洛芬，以提供镇痛。
4. 将麻醉后的大鼠俯卧位固定于立体定位仪中，鼻部置于麻醉接头内，并持续通入1.5%异氟烷。
5. 使用非穿刺式耳杆夹紧外耳道，以固定头部。
   注意：若注射时大鼠眼睛张开，应涂抹兽用眼膏以保持眼部湿润。
6. 使用浸有聚维酮碘和70%乙醇的无菌棉签交替清洁头部。
   1. 将浸有聚维酮碘的棉签接触头皮中央，并以同心圆方式向外擦拭。
   2. 使用浸有乙醇的棉签重复步骤2.6.1.1。
   3. 重复步骤2.6.1.1和步骤2.6.1.2共3次。
7. 覆盖无菌手术巾，以保护手术区域。
8. 使用无菌手术刀，在头部正中垂直做0.3 cm切口，暴露颅骨的前囟点。
   注意：若从后囟点注射，则应暴露后囟点而非前囟点。
9. 使用无菌棉签擦干该区域。

3. 设置立体定位注射仪

1. 用30G针头将步骤1.2中配制的血红蛋白溶液吸入一支0.3 mL无菌注射器中，并将注射器放入立体定位注射系统。
   ​注意：若需建立对照条件，请将步骤1.1中配制的aCSF溶液吸入0.3 mL无菌注射器，并按本方案继续操作。
2. 打开立体定位注射仪界面，点击配置按钮，输入注射体积和流速参数。
   1. 点击体积，将体积设置为20,000 nL（20 µL）。
   2. 点击输注速率，将速率设置为8,000 nL/min（8 µL/min）。
3. 点击重置位置按钮，退出配置界面。
4. 点击输注按钮，冲洗针尖，直至针尖处出现一小滴血红蛋白溶液。
5. 用无菌棉签轻轻吸去针尖处的血红蛋白溶液。

4. 动物注射

1. 设置 前囟 作为 零 通过调整注射器的内侧-外侧和前-后位置，使冲洗过的注射针针尖轻轻接触前囟处的颅骨，从而校准立体定位注射系统。
   注意： 若从人字缝处注射，则设置 λ 作为 零.
2. 确定所选坐标。
   1. 若从bregma处注射，则 P4 大鼠 此处描述的方法，使用 1.5 mm 侧向，0.4 mm 前向，2.0 mm 深度，以颅骨冠状缝前点（bregma）为参照。
   2. 若从人字缝进行注射，请使用以下坐标参数 P4 大鼠：从人字缝向侧方 1.1 mm，向前 4.6 mm，向下 3.3 mm。
3. 将注射器针头抬高至颅骨上方1 cm处，以避开头皮。抬高注射器后，继续设定正中-外侧和前-后方向的坐标。
4. 将注射器针头缓慢下降，直至轻轻接触颅骨。检查针头是否已接触颅骨。
5. 在30秒的时间段内设定背腹向坐标。
   注意： 在设定背腹向坐标时，针头将穿刺颅骨。需格外小心，确保注射器穿过颅骨时不会导致颅骨变形。若发生变形，应缓慢沿背腹向坐标撤回针头，然后重新沿相同轨迹插入针头。此操作可使针头以较小力量穿过颅骨孔洞，避免产生变形。
6. 在立体定位注射器界面上，单击 运行 开始注射按钮。
7. 注射完成后，将注射针留在原位2分钟，以尽量减少溶液回流。
8. 在2分钟内沿背腹轴缓慢撤出注射器，直至针尖位于头皮上方2 cm处。
9. 将立体定位注射臂从手术区域移开。

5. 术后护理

1. 使用6-0单股缝线缝合头皮。在0.3 cm切口的中心处做一个简单的间断缝合。
2. 将幼鼠从麻醉状态中移出，并放置在加热垫上安全的位置。
3. 将啮齿动物送回母鼠身边，使其在母鼠照护下从麻醉中恢复。
   注意：及时返回母鼠照护可降低术后早期死亡率。
4. 术后每小时监测一次动物的麻醉状态，持续3小时，以观察翻正反射是否消失。
5. 术后每日监测动物7天，观察其正常活动、摄食情况及体重增长。同时监测手术部位切口的愈合情况、闭合状况以及毛发的重新生长。
   注意：若在监测期间罕见地出现癫痫、中枢抑制或食欲减退等神经学改变，应在麻醉下通过血管灌注或颈椎脱位法对动物实施安乐死。
6. 为预防缝合后切口愈合期间发生感染，应在切口部位局部涂抹三种抗生素软膏。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.3 mL 胰岛素注射器	BD Microfine + Insulin Syringe	230-4533	0.3-0.5 mL 注射器可用
1.5 mL 微量离心管	USA Scientific	1615-5500	批号 K194642H -3 511
6-0 单股缝合线	ETHICON	667G
分析天平	CCURIS Instruments	W3200-320
人工脑脊液 (aCSF)	Tocris Bioscience	3525	批次号：72A
聚维酮碘	Purdue Products L.P.	301005-00	NDC 67618-150-09
卡洛芬（注射用）	Zoetis Inc.	PI 4019448	Rimadyl
乙醇	Decon Laboratories	2701
加热垫	Sunbeam	E12107-819	UL 612A, Z-1228-001
血红蛋白	MP Biomedicals	100714	批号 SR02321
异氟烷	Piramal Critical Care	NDC 66794-017-25
异氟烷挥发器	VETEQUIP	911103
立体定位仪用光源	Dolan-Jenner industries	Fiber-Lite MI-150
微量注射泵	World Precision Instruments	MICRO21	序列号 184034 T08K
氧气	Airgas Healthcare	UN1072	批号 S1432080XA02
SD 大鼠	Charles River Laboratories	品系编号：001
立体定位仪	KOPF Instuments	型号 900LS Lazy Susan
无菌棉签	Fischerbrand	23-400-118
手术刀片	covetrus	#10
外用三联抗生素软膏	Triple Antibiotic Ointment	NDC 51672-2120-1