在转基因小鼠模型中诱导与监测热诱导性癫痫发作

摘要

来源：Das, A.，等。癫痫小鼠模型中热诱导惊厥的行为学筛查。J. Vis. Exp. (2021)

本视频展示了通过在受控环境中逐步升高体温，以在携带癫痫相关基因突变的转基因小鼠中诱导热诱导性癫痫发作的操作步骤。该方案用于研究癫痫的发作机制及潜在治疗方法。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 热诱导惊厥实验的准备工作

1. 打开热室上的电源开启按钮，然后按下加热开启按钮。
2. 使用数字温度控制器上的键盘，将热室的温度设定为 50 °C。
3. 在将第一只小鼠放入热室前，至少等待 1 小时，使热室预热至 50 °C。预热可确保热室内温度均匀。
4. 用玉米芯垫料铺满小鼠热室的底部。
5. 在热室前方安装一台视频记录摄像机，用于记录每次热诱导癫痫发作实验的过程。
6. 用多层厚纸巾铺满直径为 140 mm 的培养皿，并将其置于冰上，作为冷却垫。
   ​注意：实验结束后，将单只小鼠转移至预先冷却的冷却垫上，以帮助降低其升高的体温。

2. 准备小鼠以进行热诱导癫痫发作检测

1. 选取10只成年小鼠（P30-P40），其中5只携带致癫痫突变，另5只为野生型同窝小鼠，用于热诱导癫痫发作筛查实验。
   注意：不携带任何致癫痫突变的野生型小鼠在低于44 °C的温度下不会出现热诱导癫痫发作，可作为对照组。
2. 称量每只用于筛查实验的小鼠，并记录其体重。仅使用体重为15 g或以上的动物进行实验。
3. 每次在小鼠加热舱中筛查一只小鼠。
4. 使用钟形罩底部的几滴异氟烷对小鼠进行短暂麻醉，持续10-15秒。
5. 将动物从钟形罩中取出，放置在一张纸巾上。
6. 通过检查小鼠对有害性足趾夹捏无反应，确认其已完全麻醉。
7. 用润滑剂（如凡士林）涂抹直肠温度探针的金属尖端，并将其轻柔插入小鼠体内，深度不超过2 cm。
8. 用胶带将直肠探针固定在小鼠尾巴上，防止其在实验过程中脱落。
   注意：也可将动物放入小鼠固定锥形管中，插入直肠温度探针，并用胶带将其固定于尾巴上。
9. 确保直肠探针已连接至可显示小鼠体内温度的多用表。
10. 将动物放入铺有玉米芯垫料的新笼子中，即恢复笼。
11. 启动计时器，等待5分钟。观察小鼠直至其完全从麻醉中恢复，表现为活动正常并开始理毛行为。
    1. 同时监测小鼠的核心体温，直至其稳定在35-36 °C。
12. 5分钟后，记录小鼠的体温。此值为“0”分钟时的初始体温。
    注意：若小鼠核心体温低于35 °C，需额外等待一段时间，使其从麻醉引起的低体温中恢复。
13. 迅速将单个小鼠转移至预热的小鼠加热舱中。此步骤标志实验试验的开始。每次仅筛查一只小鼠。

3. 热诱导惊厥实验

1. 将小鼠轻轻放置于预热的小鼠加热舱地板上后，关闭有机玻璃门，并启动摄像机以录制实验视频。
2. 启动秒表。在整个实验过程中，每隔1分钟记录一次直肠温度计测得的小鼠体温。
3. 按照固定时间间隔逐步升高小鼠加热舱的温度，使小鼠体温以0.25–0.5 °C/min的速率上升。
   注意：体温快速升高可能导致热射病或死亡，应予以避免。
4. 按照本方案，每10分钟将小鼠加热舱的温度升高5 °C，如图1A所示。
5. 在第9.5分钟时，将加热舱温度设定为55 °C，以便在第10分钟时使加热舱温度稳定在55 °C，具体以数字温度显示屏为准。
6. 同理，在第19.5分钟时将温度升至60 °C，以便在第20分钟时使加热舱温度稳定在60 °C。每次惊厥筛查试验持续30分钟。
7. 若小鼠出现惊厥（发声、点头、前肢阵挛、后肢强直伸展、侧倒或全身性强直-阵挛性惊厥），请记录以下信息：
   1. 使用直肠温度计记录小鼠惊厥期间的体温（惊厥阈值温度）。
   2. 记录小鼠表现出的惊厥行为特征，如点头、前肢阵挛、后肢伸展、侧倒和/或全身性强直-阵挛性惊厥（GTCS）。
8. 迅速但轻柔地将小鼠从加热舱中取出，并放置于步骤1.6中准备好的冷却垫上。
   注意：若小鼠正处于Racine 5级惊厥并伴有不受控制的跳跃行为，可能难以将其从加热舱中安全转移至外部冷却垫。然而，典型的热诱导惊厥持续时间为30至60秒。因此，应在热诱导惊厥发作开始后的60秒内将小鼠移出加热舱并置于冷却垫上。
9. 待小鼠体温降至36–37 °C后，再将其转移至恢复笼中。每次仅将一只小鼠放入一个恢复笼中。
   注意：切勿将尚未接受热诱导筛查的小鼠与已完成热诱导惊厥实验的小鼠混养。
10. 使用剪刀小心而轻柔地剪断小鼠尾部与直肠探针导线之间的胶带，以取下直肠探针。
11. 用70%酒精和柔软的纸巾清洁直肠探针的金属尖端，使其保持清洁，以备下一次实验使用。
12. 将小鼠置于恢复笼中继续观察，直至其恢复正常的活动行为（如行走、理毛等），然后将其送回原饲养笼。至此，该小鼠的实验试验结束。
13. 记录实验后动物的状态：存活并从测试中恢复，或死亡。高强度惊厥（如不受控制的跳跃和全身性强直-阵挛性惊厥）有时可能导致小鼠死亡。
14. 若小鼠在30分钟观察期内未出现热诱导惊厥，或其体温已达44 °C，则应立即将其从加热舱中移出，并置于冷却垫上，直至体温恢复至36–37 °C。
15. 将小鼠加热舱的温度重置为50 °C，并使其平衡，直至数字温控器显示温度稳定在50 °C。
16. 在每只小鼠实验结束后更换垫料中的玉米芯 bedding。

结果

图 1：突变小鼠表现出热诱导惊厥。（A）小鼠热诱导惊厥行为筛查的加热方案。（B-C）在两种遗传背景 129X1 和 B6N 中，野生型（Scn1a+/+ — 黑色三角形）和杂合突变型（Scn1aKT/+ — 橙色圆形）小鼠随时间变化的平均体温。（D）在两种遗传背景下出现热诱导惊厥的小鼠百分比。野生型（Scn1a+/+）和杂合型（Scn1aKT/+）小鼠分别以黑色和橙色柱表示。129X1 和 B6N 遗传背景下的杂合突变体分别以实心橙色柱和带黑色条纹的橙色柱表示。...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
轴流风扇	Farnam	AF20-200-120-xx10-3.1	Farnam 定制产品 - 带风扇的轴流风扇加热器
数字温度控制器	Inkbird	ITC-100RH	配备K型热电偶的Inkbird数字PID温度控制器ITC-100RH
小鼠直肠温度探头	ThermoWorks, Braintree Scientific, Inc	RET-3	带温度计的小鼠直肠温度探头