大鼠海马切片中中间神经元的免疫染色

摘要

Swietek, B., 等 用于神经化学标志物的生物胞素填充并处理切片的免疫染色。 J. Vis. Exp. (2016)

本视频展示了在大鼠海马切片中对生物胞素标记的中间神经元进行可视化的过程，通过使用特异性抗体和荧光显微镜技术突出其神经化学特性。

方案

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 一抗与生物素的染色

（第1天）
注意：以下免疫染色步骤适用于游离漂浮切片，所有孵育步骤均需在摇床上以低速持续震荡（2转/分钟，rpm）进行。

1. 用 0.1 M PBS（pH = 7.4）清洗组织，每次 10 分钟，共洗 3 次。
   注意：0.1 M PBS 可购买商用产品，也可在实验室配制（配制 1 L）：将 8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na₂HPO₄ 和 0.24 g KH₂PO₄ 溶于 1 L 去离子水（dH₂O）中。
   注意：若已知目标神经化学标记物，可同时进行蛋白/肽的染色 （步骤 1.2 - 1.4）。若仅进行生物胞素染色，则继续进行 步骤 1.5。
2. 可选：用封闭液（BS；含 0.3% Triton X-100 的 PBS 配制的 10% 封闭血清（正常山羊血清，NGS））在室温下封闭 1 小时。
   注意：每个孔应加入相同体积的溶液，推荐体积为 250 - 500 µL/孔。封闭血清的选择应基于二抗的宿主物种（例如，使用偶联染料的山羊抗-（相应一抗宿主物种）二抗时，选用 NGS）。若需使用来自不同物种的二抗对切片进行免疫染色，则在封闭步骤（2）中加入每种正常血清各 10%，在一抗和二抗孵育步骤中各加入 3%。
3. （可选）将切片在含 0.3% Triton X-100 和 3% 封闭血清（BS）的 0.1 M PBS 中，于室温下与一抗 CB₁R（多克隆抗体，豚鼠来源）共同孵育过夜。CB₁R 用于鉴定大麻素受体 1 型的表达。
   注意：此步骤为可选，非显示生物胞素填充所必需。图 2 展示了在首次染色过程中同时标记生物胞素和 CB₁R 的切片。大多数一抗在室温下过夜孵育已足够；然而，某些一抗（包括 CB₁R）需要 3 - 5 天的孵育时间。若孵育时间超过 1 天，建议在 4 °C 下进行，因为 Triton X-100 可使组织切片通透，在室温长时间孵育可能导致组织解体。每批实验至少应包含一个不加一抗的阴性对照切片，以验证二抗的特异性。阴性对照中省略一抗，但仍加入含 0.3% Triton X-100 的 0.1 M PBS 和封闭血清（BS）。

（第2天）

4. 用 0.1 M PBS（pH = 7.4）清洗脑切片，每次 10 分钟，共洗 3 次。
5. 将切片在含有 0.3% Triton X-100 和 3% BS 的 0.1 M PBS 中，于 4 °C 避光过夜（用铝箔包裹）孵育，加入链霉亲和素-红色荧光染料偶联物（浓度：1:1,000；激发波长：594 nm，发射光位于可见红光光谱范围），以显示生物胞素标记。可选步骤：若在步骤 1.3 中进行了可选的一抗孵育，则可在上述孵育中同时加入二抗——山羊抗豚鼠抗体（浓度：1:500；激发波长：488 nm，发射光为绿色）。
   注意：仅当执行了可选的一抗染色步骤（步骤 1.3）时，才需要使用二抗。为可视化生物胞素，建议使用发射光谱位于红色区域的链霉亲和素-荧光染料偶联物，因其可更清晰地显示细小轴突，并提供更好的对比度（图 1 - 3）。

（第3天）

6. 用 0.1 M PBS（pH = 7.4）清洗脑切片，每次 10 分钟，共洗 3 次。
7. 为保护荧光信号并便于将来重新染色，将切片封片于水性封片剂中，并用透明指甲油密封盖玻片边缘。
   注意：建议尽早重新染色，以避免因封片剂从载玻片泄漏导致难以去除指甲油、霉菌污染以及组织脱水等问题。可在 PBS 中加入 0.02% 叠氮化钠以防止微生物污染。
   警告：叠氮化钠在接触水时具有高毒性且易燃。请参照危险化学品的标准操作规程进行操作与处置。
   （第 4–7 天）
8. 使用 594 nm 和 488 nm 激发光，以 20X 或 40X 放大倍数进行共聚焦成像，以显示呈红色的生物胞素标记神经元和呈绿色的神经化学标志物（CB₁R）。评估共标结果（图 2）。
9. 将相机曝光时间设置为小于 100 ms，以避免光漂白，并获取整个神经元轴突和树突树突的共聚焦图像序列。利用共聚焦图像序列及神经元追踪软件包重建神经元形态。

结果

图1. 进行生物胞素填充时建议的细胞接近平面。 图像显示了一个在记录过程中用生物胞素填充的颗粒细胞（GC），经处理后显示生物胞素信号（使用594标记的链霉亲和素，呈红色）。该颗粒细胞的树突位于XY平面。注意由于移液管在XY平面移动，导致颗粒细胞轴突被切断（绿色箭头所示）。应注意，理想情况下应沿XZ平面接近该神经元。比例尺：50 µm。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
NaCl	Sigma	S7653	免疫染色
KCL	Fluka	60129	免疫染色
磷酸氢二钠	Sigma	S7907	免疫染色
磷酸二氢钾	Sigma	229806	免疫染色
Triton X-100	Sigma	T8787	免疫染色
豚鼠抗 CB1 抗体	Sigma	Af530-1	免疫染色
链霉亲和素，Alexa Fluor 偶联物	Molecular Probes	S11227	免疫染色
正常山羊血清	Sigma	G9023	免疫染色
Vectashield	Vector Labs	H-1000	免疫染色
二抗	Invitogen Molecular probes	Alexa Fluor 偶联染料	免疫染色
Labnet orbit 低速摇床	Bioexpress	S-2030-LS	免疫染色
镊子	Dumont	11231-30	免疫染色
载玻片盒	EMS	71520	免疫染色
生物素标记物（Biocytin）	Sigma	B4261	电生理学