人直肠抽吸活检组织切片中S-100蛋白的免疫组织化学染色

摘要

来源：Chi, S., Fang, et al. 通过钙调蛋白结合蛋白、S100蛋白及蛋白基因产物9.5免疫染色诊断先天性巨结肠病的直肠抽吸活检法。J. Vis. Exp. (2019)

本视频演示了直肠抽吸活检切片中 S-100 蛋白的免疫组织化学染色。经抗原修复的切片进行封闭后，依次使用抗 S-100 的一抗和二抗处理，S-100 是先天性巨结肠症的标志物。加入显色底物以染色靶细胞。样本经脱水、封片后，在显微镜下观察。

方案

1. 直肠吸引活检（RSB）切片的制备

1. 将直肠吸引活检组织置于4%多聚甲醛中固定6小时，固定液体积应为组织体积的5倍以上。
2. 使用病理组织脱水机对组织进行11小时脱水。整个程序化过程包括以下5个步骤：
   1. 将组织置于甲醛中固定1小时。
   2. 将组织置于75%乙醇中4小时。
   3. 将组织置于无水乙醇中（更换两次，每次1小时）。
   4. 将组织置于无水乙醇中（更换两次，每次30分钟）。
   5. 将组织置于二甲苯中（更换三次，每次1小时）。
3. 将组织置于石蜡（58–60 °C）中（更换三次，每次1小时）。将直肠吸引活检组织包埋于石蜡块中。
4. 使用切片机修整石蜡块，直至组织完全暴露并形成完整的切面。
5. 用切片机将石蜡块切成0.4 μm的切片。
6. 将切片依次放入45–50 °C的水中数秒钟，使切片展开成平整状态。
7. 将石蜡切片转移至载玻片上。
8. 将载玻片置于60 °C烘箱中烘烤3–5小时。避免烘烤时间过长，以免导致抗原丢失。
9. 将脱蜡后的载玻片放入二甲苯中（更换两次，每次15分钟）。
10. 将载玻片依次在无水乙醇、95%乙醇、80%乙醇和75%乙醇中各水化5分钟，然后用反渗透（RO）纯化水冲洗5分钟。

2. 抗原修复

1. 通过将4 mL乙二胺四乙酸（EDTA）抗原修复缓冲液与200 mL反渗透纯化水混合，制备用于钙视网膜蛋白（calretinin）修复的工作液。通过将1 mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（100倍浓缩液）与99 mL反渗透纯化水混合，制备用于S100和蛋白基因产物9.5（PGP9.5）修复的工作液。
    注意：钙视网膜蛋白优先使用EDTA修复液进行修复。然而，柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液更适用于S100和PGP9.5的修复。
2. 将切片放入Coplin染色缸中，加入修复液并置于预热的沸水浴中。煮沸20分钟后，将染色缸从水浴中取出，静置冷却至室温，冷却过程约需10分钟。取出切片后，用磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻冲洗一次。
3. 用记号笔在组织周围画一圈，并为后续步骤准备湿盒。

3. 封闭

1. 通过将 3 mL 的 30% H₂O₂ 与 27 mL 反渗透纯化水混合，配制工作液。
2. 将两到三滴 3% H₂O₂ 溶液逐滴加至组织上，以阻断过氧化物酶活性。应迅速加入 H₂O₂ 溶液，确保其不溢出画圈区域。在 37 °C 培养箱中孵育 20 分钟以阻断过氧化物酶。
3. 用 PBS 轻柔冲洗载玻片（每次 5 分钟，共洗三次）。
4. 用 5% 牛血清白蛋白（BSA，将 1.5 g BSA 粉末溶于 30 mL 反渗透纯化水中配制）在 37 °C 下封闭载玻片 20 分钟。
    注意：使用 3% 过氧化氢封闭可消除 95% 的非特异性染色，而使用 5% BSA 封闭可消除其余 5% 的非特异性染色。结合使用这两种方法可获得可靠的结果。

4. 抗原-抗体反应

1. 去除 5% BSA，向切片中加入 50 μL 一抗（calretinin、S100 或 PGP9.5），在 4 °C 下孵育过夜。
2. 用 PBS 洗涤切片（每次 3 分钟，共 3 次）。
3. 向切片中加入 50 μL 聚合物增强剂（试剂 A；参见 材料表），在 37 °C 培养箱中孵育 20 分钟。然后用 PBS 洗涤切片（每次 3 分钟，共 3 次）。
4. 向切片中加入 50 μL 二抗 B（山羊抗兔/小鼠 IgG 二抗），在 37 °C 培养箱中孵育 30 分钟。用 PBS 洗涤切片（每次 5 分钟，共 3 次）。

5. 3,3-二氨基联苯胺与苏木精染色

1. 向1.5 mL离心管中加入850 μL反渗透纯化水，并按A、B、C的顺序加入染色试剂（见材料表）。每种试剂各加50 μL，得到总量为1 mL的3,3-二氨基联苯胺（DAB）工作液。如有沉淀，请过滤后使用。
2. 向组织切片滴加一滴DAB工作液，染色3–10分钟。将切片在室温下孵育于DAB溶液中，直至出现棕褐色染色。使用明场显微镜密切观察。DAB工作液需避光保存。随后用PBS冲洗切片5分钟。
3. 滴加一滴苏木精对细胞核进行复染，约1分钟。然后手持柯林瓶，在细流水中冲洗约30–40秒，直至去除多余染料。注意避免损伤组织切片。
4. 将RSB切片浸入盛有PBS的柯林瓶中，持续25–30秒。随后在1%盐酸乙醇中分化10秒。再用PBS冲洗切片1分钟。
5. 按与水化相反的顺序进行脱水：75%、80%、95%及无水乙醇（每种浓度各5分钟）。
6. 将切片置于二甲苯中处理（更换两次，每次5分钟）。
7. 使用超净封片剂封片。封片后让切片干燥，再通过显微镜观察。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
钙视网膜蛋白抗体	MXB Biotechnologies	MAB-0716 170416405c	抗体：一抗
S-100抗体	MXB Biotechnologies	Kit-0007	抗体：一抗
PGP9.5抗体	上海龙岛抗体有限公司	R-0457-03	抗体：一抗
增强试剂	MXB Biotechnologies	KIT-9902-A 170416405a	抗体：二抗A
羊抗兔/鼠IgG二抗	MXB Biotechnologies	KIT-9902-B	抗体：二抗B
DAB染色试剂盒（含试剂A、B和C）	MXB Biotechnologies	DAB-0031	染色试剂盒
恒温培养箱	上海一恒仪器有限公司	DHP-9082	仪器
Rbi2负压直肠活检系统	Aus Systems Pty Ltd, South Australia, Australia	CP1200 HP1000 SS1000	仪器
切片机	Leica	leica RM2016	仪器
柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液(100X)	MXB Biotechnologies	MVS-0101	抗原修复缓冲液
病理组织脱水机	武汉俊杰电子有限公司	JT-12F	仪器