小鼠脑皮层切片中自发性与按需诱发痫性事件的产生

摘要

来源：Chang, M. 等。啮齿类及人类组织中急性发作活动的生成与按需启动。J. Vis. Exp. (2019)

本视频展示了在表达光敏阳离子通道的转基因小鼠的冠状皮层脑片中诱发痫性事件的方法。将脑片置于记录室中，并将记录电极插入皮层浅层。当灌流阻断钾通道的致痫药物后，神经元变得过度兴奋，并产生自发性痫性事件。为了按需诱发痫性事件，可通过短暂的光脉冲激活锥体神经元中的阳离子通道，从而触发兴奋性神经递质的释放，继而诱导突触后神经元在短时间内产生痫性事件。

方案

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 解剖溶液与人工脑脊液的制备

1. 使用气石曝气装置（水族箱用曝气器）将超纯水（电阻率为 18.2 MΩ·cm 的过滤水）用碳酰气（95% O₂/5% CO₂）碳酸化处理 5 分钟。
   注意：气石可通过标准硅胶管连接至碳酰气钢瓶的减压阀 via 。若无气石，可将硅胶管末端密封，并在密封处刺若干小孔，使碳酰气以气泡形式缓慢释放，从而实现溶液的碳酸化。
2. 按照 表 1 中的溶质成分，将其溶解于超纯水中，配制解剖液。将 CaCl₂ 加入已用碳酰气处理至少 5 分钟的溶液中，以促进其溶解。
   注意：也可先加入 CaCl₂ ，使其在未饱和溶液中更易溶解。该溶液在液态时，经碳酰气饱和后，渗透压应为 300 - 320 mOsm/L，pH 值应为 7.4。
   1. 将解剖液冷却至 0 - 4 °C。可将溶液置于冰箱中过夜，或放入冷冻箱中 1 小时，并持续监测温度。
      注意：解剖液最多可保存 3 个晚上；之后应弃用。
   2. 使用前，用碳酰气对解剖液碳酸化处理 5 - 10 分钟。
      注意：理想状态下，溶液在使用前应呈冰沙状或正在转变为冰沙状。
3. 按照 表 2 中的溶质成分，将其溶解于超纯水中，配制啮齿类动物人工脑脊液（ACSF）。将 ACSF 溶液置于 35 °C 水浴中，并持续用碳酰气碳酸化，直至使用。将 CaCl₂ 加入已用碳酰气处理至少 5 分钟的溶液中，以促进其溶解。
   注意：也可先加入 CaCl₂ ，使其在未饱和溶液中更易溶解。该溶液在液态时，经碳酰气饱和后，渗透压应为 290 - 320 mOsm/L，pH 值应为 7.4。根据实验持续时间，可按 1 L、2 L 或 4 L 的体积配制溶液。若进行一整天（8 小时）的实验，建议配制 4 L。ACSF 应每日新鲜配制，保存时间不得超过 1 天。

2. 小鼠解剖以收集脑组织

1. 收集动物解剖所需的所有工具和材料。布置工作区域，为动物解剖做好准备。
   1. 检查碳氧混合气罐（95% O₂ + 5% CO₂）₂/5%CO₂₂) 以确保其不为空。若气瓶压力低于500 psi，应在实验前更换气瓶。
   2. 根据制造商的操作手册校准振动切片机（vibrating blade tissue slicer）。将振动切片机的参数设置为切割振幅1 mm，切割速度0.12 mm/s。
      注意： 每台振动组织切片刀的最佳设置可能有所不同；但通常情况下，振幅应调至较高，而切割速度应保持较低。
   3. 填充脑切片孵育室（即，脑片保存装置）中加入ACSF并用碳氧混合气体饱和。随后将孵育装置置于设定为35℃的水浴中 °C.
2. 取一只13天龄（p13）至21天龄（p21，其中p0为出生日）的幼年小鼠，性别不限。
3. 用戊巴比妥钠（55 mg/kg 体重）腹腔注射麻醉小鼠。当小鼠深度麻醉，表现为脚趾夹捏反射消失时，立即使用 经兽医批准的断头器，用于迅速切断小鼠头部。
   注意： 根据机构指南推荐的程序配制戊巴比妥钠注射液。
4. 用手指固定小鼠的鼻部以稳定断头后的头部，从两眼之间开始沿头皮全长轻轻做正中切口，以暴露颅骨。确保剃刀施加的压力不会压迫颅骨。使用剃刀刃的尖角部分以提高切割的精确性。
5. 用手指撑开小鼠头皮的皮瓣，暴露颅骨。然后，使用刀片锋利的崭新边缘沿颅骨中线做切口，注意避免与大脑皮层接触。
6. 将裂解镊插入小鼠的眼眶以固定断头，并将其置于盛有冷（0 - 4 ℃）溶液的培养皿中 °C) 解剖液。确保头部完全浸没在解剖液中。
7. 使用另一把尖头镊子轻轻剥离小鼠的头皮，撕下鼻骨，并去除颅骨后部（尾侧）。
   注意： 幼鼠的鼻骨非常柔软，容易折断。
8. 使用微型刮勺切断视神经、三叉神经和脊髓。然后用微型刮勺轻轻将脑组织从颅骨中分离。将脑组织完全浸没在盛有解剖液的培养皿中。

3. 体感运动皮层脑片的制备

1. 将约 150 mL 冷的（0 - 4°C）解剖液加入振动切片机的缓冲槽中。
   注意：可选操作：可将缓冲槽置于冰箱中冷藏至使用前，以在切片过程中维持较低温度。
2. 使用速干胶将小鼠脑组织粘附于振动切片机的载物台（样品架/托盘）上。对于小鼠，可切除脑组织尾端的一小部分（即小脑），以便将其平稳地粘贴在样品架上（使脑组织头端朝上，面向天花板）。
   注意：也可选择将脑组织背侧朝下粘附于样品架上，以制备水平方向的小鼠脑切片（此时脑组织腹侧应朝上，面向天花板）。
3. 轻柔地将载物台（连同脑组织）放入缓冲槽中。确保脑组织的背侧朝向振动切片机的刀片。
   注意：必须尽量减少脑组织暴露于空气中的时间。

4. 脑组织切片与收集

1. 将脑组织切成450 μm厚的切片 μ使用振动切片机从背侧向腹侧切出 m 厚的脑片。切片过程中应确保脑组织始终完全固定于样品托上。
   1. 在小鼠脑中进行第一次切割以去除嗅球。随后继续进行切割，直至观察到体感-运动区（位于嗅球与前囟之间约中点处）。
      注意： 可选地，将脑组织切成更薄的切片（200 μm) 切片至在脑的冠状切面中出现胼胝体，表明已接近体感运动区。
2. 使用宽口移液管收集冠状切片（450 μm）包含躯体感觉运动区，并将其浸入含有冷（0 - 4 ℃）的培养皿中 °C）解剖液。
3. 使用新的剃须刀片，切除切片上多余的组织。对于小鼠的冠状切片，在新皮质联合下方进行横向切割。即，胼胝体）。切片时不要使用锯切动作，只需将刀片垂直施压切入组织，并用精细毛刷轻轻分离组织。注意尽量减少冠状切片的移动。
4. 使用宽口移液管将包含新皮层（第1-6层）的冠状切片背侧部分转移至第二个盛有温热（35℃）人工脑脊液的培养皿中 °C) ACSF 约 1 秒。随后立即将切片转移至含有温热（35 °C）通入碳合气体的任氏液（carbogenated ACSF）。
   注意： 将脑片转移到含ACSF的培养皿中的目的是在使用宽口移液管转移脑片时，尽量减少解剖液带入孵育室。利用孵育室的多个孔位，对不同的脑片进行有序存放。
5. 根据机构规定处理剩余的脑组织和动物尸体。

5. 培养与维持

1. 将脑片在35 °C条件下略微浸没于孵育 chamber 中孵育30分钟。随后将孵育 chamber 从水浴中取出，使其恢复至室温（20 - 25 °C）。在进行电生理记录前，等待1小时使脑片充分恢复。
   注意：确保孵育 chamber 中脑片下方无气泡积聚。气泡形成的气液界面可导致组织损伤。小鼠脑片可在充分通入碳合气的孵育 chamber 及ACSF中维持6 - 8小时。

6. 大脑皮层浅层的电生理记录

注意：癫痫样放电事件可在脑片的细胞外局部场电位（LFP）记录中观察到。脑片的局部场电位可通过界面式记录舱或浸没式多电极阵列（MEA）系统进行观察和记录。

1. 使用宽口移液管或精细画笔将脑切片转移至由齿科镊子固定、尺寸略大的预裁镜头纸上。将带有脑切片的镜头纸转移至记录室，并用网格固定器（harp screen）将其固定到位。
2. 运行温热（35 °C），以3 mL/min（约每秒1滴）的速度将通入碳合气的ACSF灌流液通过记录室并流过脑片。使用数字温度计确保记录室温度维持在33–36°C.
3. 使用拉制仪制备阻抗为 1 - 3 MΩ 的玻璃电极‎Ω 使用拉制仪从硼硅酸盐玻璃管（外径为1.5 mm）制备玻璃电极，并用ACSF反向填充（约10 µ使用 Hamilton 注射器将液体加入。如果电极尖端损坏，应立即丢弃。
   注意： 漂白银丝（5 分钟），仅让极小部分（即将银丝的尖端浸入回填了ACSF的玻璃电极中，以尽量减少记录过程中的噪声和漂移。如有必要，使用汉密尔顿注射器移除玻璃电极中多余的ACSF。
4. 使用20倍体视显微镜，通过手动操作器将记录玻璃电极准确引导至皮层浅层（第2/3层）。利用标准软件在计算机上记录/观察脑片的电活动。
   注意： 存活良好（高质量）的脑片在施加电刺激（100）后会表现出显著的诱发电位 µ秒，30 - 300 μA）或光脉冲（30 ms，10 mW/mm²）²用于光遗传学组织

7. 诱发类癫痫活动

1. 将含有 100 µM 4-氨基吡啶（4-AP）的 ACSF 灌注于脑片上。将 80 mg 4-AP 溶解于 8.5 mL 水中，配制成 100 mM 的 4-AP 储存液。取 100 µL 的 100 mM 4-AP 储存液加入 100 mL ACSF 中，得到含 100 µM 4-AP 的灌注用 ACSF。
   注意：也可选用无镁 ACSF（Zero-Mg²⁺ ACSF）（表 3），即一种未添加 Mg²⁺ 的改良 ACSF 溶液，用于脑片灌注。癫痫样放电事件通常在 15 分钟左右出现，但某些脑片可能需要长达 40 分钟。

8. 按需诱发癫痫发作：一种用于光遗传学小鼠的光遗传学策略

1. 施加短暂（30 ms）的蓝色（470 nm）光脉冲（最小功率为1 mW/mm²）² 输出强度）以诱发痫性事件。使用手动操作器将1,000 µ直径为 m 的光学纤维（数值孔径 0.39）直接置于记录区域上方。
   注意： 将光刺激的频率设置为与期望的痫性事件发生频率一致（即，每50秒1次脉冲）。然而，该频率不能过度偏离癫痫发作事件的固有发生率。

表1：解剖液配方。 以下为配制1 L或2 L体积的说明。MW = 溶质的分子量。

#	试剂	浓度 [mM]	分子量 (g/mol)	1L (g)	2L (g)
1	Sucrose	248	342.3	84.89	169.78
2	Sodium Bicarbonate (NaHCO2)	26	84.01	2.18	4.37
3	Dextrose (D-glucose)	10	180.16	1.8	3.6
4	Potassium Chloride (KCl)	2	74.55	0.15	0.3
5	Magnesium Sulfate (MgSO4·7H2O)	3	246.47	0.74	1.48
6	Sodium phosphate monobasic monohydrate (H2NaPO4·H2O)	1.25	137.99	0.17	0.34
7	Calcium Chloride (CaCl2·2H2O)	1	147.01	0.15	0.29

表2：啮齿类动物人工脑脊液（ACSF）配方。 以下为配制2 L或4 L体积的说明。MW = 溶质的分子量。

#	试剂	浓度 [mM]	分子量 (g/mol)	2L (g)	4L (g)
1	氯化钠 (NaCl)	123	58.4	14.37	28.73
2	碳酸氢钠 (NaHCO2)	26	84.01	4.37	8.74
3	右旋葡萄糖 (D-葡萄糖)	10	180.16	3.6	7.21
4	氯化钾 (KCl)	4	74.55	0.6	1.19
5	硫酸镁 (MgSO4·H2O)	1.3	246.47	0.64	1.28
6	磷酸二氢钠一水合物 (HNaPO4·H2O)	1.2	137.99	0.33	0.66
7	氯化钙 (CaCl2·2H2O)	1.5	147.01	0.44	0.88

表3：无镁离子（Zero-Mg²⁺ ）啮齿类动物人工脑脊液（Zero-Mg²⁺ ACSF）配方。 以下为配制2 L或4 L体积的说明。MW = 溶质的分子量。

#	试剂	浓度 [mM]	分子量 (g/mol)	2L (g)	4L (g)
1	氯化钠 (NaCl)	123	58.4	14.37	28.73
2	碳酸氢钠 (NaHCO2)	26	84.01	4.37	8.74
3	右旋葡萄糖 (D-葡萄糖)	10	180.16	3.6	7.21
4	氯化钾 (KCl)	4	74.55	0.6	1.19
5	硫酸镁 (MgSO4·H2O)	名义上无	246.47	0	0
6	一水合磷酸二氢钠 (HNaPO4·H2O)	1.2	137.99	0.33	0.66
7	二水合氯化钙 (CaCl2·2H2O)	1.5	147.01	0.29	0.59

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
戊巴比妥钠	N/A	N/A	通过多伦多西部医院供应商购买
1 mm 注射器	N/A	N/A	通过 UT Med Store 购买
25G 5/8" 无菌针头	N/A	N/A	通过 UT Med Store 购买
单刃剃须刀片（2个）	N/A	N/A	通过 UT Med Store 购买
速干胶水	N/A	N/A	通过 UT Med Store 购买
镜头纸	N/A	N/A	通过 UT Med Store 购买
玻璃培养皿（2个）	N/A	N/A	通过 UT Med Store 购买
细小镊子（2个）	N/A	N/A	通过 UT Med Store 购买
PVC 手柄微型刮勺	N/A	N/A	通过 UT Med Store 购买
平头微型小勺	N/A	N/A	通过 UT Med Store 购买
5/0 细节画笔	N/A	N/A	从一家精品艺术商店购买
宽口移液管	N/A	N/A	通过 UT Med Store 购买
牙科镊子	N/A	N/A	通过 UT Med Store 购买
温度计（数字式）	N/A	N/A	在 Amazon.ca 上购买
检查碳合气气罐（95%O2/5%CO2）	N/A	N/A	通过多伦多西部医院供应商购买
振动切片机	Leica	N/A	通过多伦多西部医院供应商购买
脑切片孵育室（又称脑切片保存装置）	Scientific Systems Design Inc	N/A
氯化钠 (NaCl)	N/A	N/A	通过 UT Med Store 购买
碳酸氢钠	N/A	N/A	通过 UT Med Store 购买
右旋葡萄糖	N/A	N/A	通过 UT Med Store 购买
氯化钾 (KCl)	N/A	N/A	通过 UT Med Store 购买
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一水合磷酸二氢钠 (HNaPO4·H2O)	N/A	N/A	通过 UT Med Store 购买
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