通过大脑中动脉与颈总动脉阻断在大鼠模型中诱导缺血

摘要

来源：Wayman, C. 等，在老年大鼠中实施永久性远端大脑中动脉联合颈总动脉阻塞以研究皮质缺血伴持续性功能障碍。J. Vis. Exp. (2016)

本视频演示了在老年大鼠中进行远端大脑中动脉永久性阻塞（MCAO）并结合颈总动脉（CCA）结扎以模拟缺血性脑卒中的操作步骤。该方法可阻断脑部血流，导致神经元死亡，从而建立用于研究脑卒中机制及潜在治疗方法的动物模型。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 手术

1. 使用16至18月龄（250至400 g）的雌性老年Lister-Hooded大鼠，以1.5 L/min氧气中含5%异氟烷诱导麻醉₂麻醉诱导后，降低异氟烷浓度，并将其维持在满足手术需求但尽可能低的麻醉深度例如，1.5-2%）。通过面罩向动物输送麻醉剂，并使用废气清除系统以减少外科医生接触异氟烷。
   1. 对假手术动物执行除开颅术以外的所有操作步骤，因为开颅术本身可能导致行为学缺陷。在设计大脑中动脉闭塞（MCAO）实验时，应考虑实验目的，并决定是否设置假手术组以对照开颅术的影响。
2. 术前或围手术期给予镇痛（Carprieve，0.25 mg/kg，皮下注射）。
   1. 加入1 ml至19 ml无菌0.9%生理盐水中配制储备液，按每300 g大鼠注射0.6 ml。优先使用Carprieve而非Carprofen，因为前者在室温（RT）下稳定。
3. 剃除右侧半球颞区和腹侧颈部区域的毛发，以暴露皮肤。使用乙醇棉片对手术部位进行消毒。
   1. 在远离操作区域的位置执行此步骤，以尽量减少切口部位的毛发残留。
4. 将大鼠仰卧位放置在覆盖无菌铺巾的软木板上，并置于加热垫上。在头部和颈部已剃毛的区域涂抹利多卡因乳膏。插入直肠探头，通过恒温系统监测并维持动物体温在36.5–37.5 °C之间。
   1. 在眼睛上涂抹lacrilube眼膏以防止干燥。皮下注射硫酸阿托品溶液（0.05 ml，浓度为600 µg/ml）以减少气管分泌物。
      注意： 研究人员应考虑测量血气和血压等生理学指标。
5. 手术开始前，检查后肢足垫夹捏回缩反应和眨眼反射，以确认麻醉完全。
6. 在解剖显微镜下，使用手术刀于暴露的颈部正中做一条长约2 cm的纵向切口。轻柔地将两侧位于气管外侧的唾液腺向侧方推开。
7. 在单侧颈总动脉表面的皮肤上，用不可吸收的丝线缝合打环。用丝线轻轻牵拉皮肤，并用医用胶带将其固定在软木板上，以暴露颈总动脉。使用精细镊子小心钝性分离动脉，使其脱离周围筋膜及迷走神经。
   1. 注意在此步骤中不要损伤肌肉或迷走神经，否则会影响摄食、吞咽和呼吸功能。
8. 暴露颈总动脉后，使用不可吸收的丝线（5/0）分离颈动脉，先用精细镊子逆向解剖，将颈动脉与迷走神经分开，注意避免接触神经。将丝线穿过血管并形成环状（但暂不打结）后，用外科胶带将丝线两端粘在一起，以防此步骤松脱。随后移除牵拉固定皮肤的缝线。
9. 另一侧重复相同操作。
10. 将无菌生理盐水浸湿的纱布放入伤口内，以保持组织在手术剩余过程中的湿润。 loosely 缝合皮肤，并在该区域覆盖额外的生理盐水浸湿纱布，以防止进一步脱水。
11. 将大鼠置于侧卧位，在右侧眼眶与外耳道之间的中点处切开皮肤。使用最多五个3 mm弹性钩状拉钩将皮肤向两侧牵开并固定于软木板上，随后钝性分离颞肌以暴露颅骨。
12. 在开放部位上方放置一个由拇指轮调节的重力驱动生理盐水滴注装置（流速约为2 ml/min），并设置吸引装置系统，以清除骨碎片并吸除手术暴露区域的少量出血，此操作需在整个手术阶段持续进行。
    1. 将生理盐水输送管的喷嘴置于靠近耳部的颅骨最高点，吸引管喷嘴置于最低点。在出血期间通过调节旋钮向该区域补充更多生理盐水，以更清晰地观察出血来源，便于对血管进行电凝，从而缩短动物处于麻醉状态的时间。
13. 使用牙科钻机配以直径1.6 mm的粗颗粒金刚石钻头，在转速约8,000 rpm下对暴露区域（约5 mm × 5 mm）进行开颅手术，钻孔时施加环形和侧向压力，避免施加垂直向下的压力。当骨片钻至完全透明时，用镊子将其移除。
14. 使用自制的硬脑膜钩（通过将精细镊子的一端弯曲约180°形成弧形）小心地打开硬脑膜，注意避开较大的表层血管，因其较为脆弱，容易破裂。
    注意： 暴露的脑区将显示出大脑中动脉（MCA）；目标节段长约2 mm（参见 图1).
15. 从下脑静脉跨越处开始，沿大脑中动脉向远端至动脉分叉处，再沿大脑中动脉的尾侧分支，使用双极电凝镊进行电凝，直至完全闭塞。使用0.25 mm尖头的弯头珠宝匠双极电凝镊。
    1. 阻断动脉时，根据需要调整生理盐水流速，以保持该区域冷却，防止凝血钳粘附于血管。完全阻断后，血管呈黑色，且无血流迹象；部分阻断的血管中仍可见血流。
    2. 在此处切断大脑中动脉（MCA）以确认完全阻塞。使用显微血管剪，在下脑静脉跨越MCA的位置下方进行剪断。
    3. 用生理盐水浸湿的纱布覆盖暴露区域，然后继续下一步操作。
16. 将大鼠转回仰卧位，重新打开颈部先前松扎的缝线以再次暴露颈动脉。用丝线在颈动脉周围打结，永久结扎与阻塞的中动脉（右侧）同侧的颈动脉；同时使用压力为125 g的13 mm不锈钢动脉夹夹闭左侧颈动脉，进行60分钟的暂时性阻断。在此期间，将颈部切口 loosely 缝合，并覆盖无菌生理盐水浸湿的纱布，以防止脱水。
    1. 注意，由于动物处于仰卧位，其右侧将位于手术者左侧。

结果

图1. 永久性远端大脑中动脉阻塞模型的手术装置。 图中显示了用于大鼠开颅手术的右侧半球手术装置，插图展示了吸引器及围绕颅骨切除部位的生理盐水滴注位置。同时标出了脑血管的关键结构：大脑中动脉（红色）和大脑下静脉（蓝色），阴影区域表示动脉凝固发生的部位。通过在大脑下静脉下方切断大脑中动脉（MCA）来确认阻塞效果。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
卡洛芬	Norbrook	Vm No; 02000/4229	给予 0.25 mg/kg
硫酸阿托品	AmTech	RXATRINJ-100
酒精棉片	UHS	20021
利多卡因乳膏（Emla）	AstraZeneca	12901	在剃毛的颈部和颞区涂抹豌豆大小的一滴
恒温毯系统	Harvard Instruments	507222F
镊子	Fine Science Tools	11019-12
异氟烷	Abbott	B506
丝线缝合线	Harvard Apparatus	723288
电灼系统	Eschmann
0.25 mm 珠宝商电灼镊	Eschmann	8330349
精细 Dumont 镊子	Fine Science Tools	11251-10
拇指驱动生理盐水滴注系统
Vacusafe 吸引系统	INTEGRA BIOSCIENCES	158320
16 mm 粗粒金刚石涂层钢磨头		K801 104 016
手持式牙科钻	NSK	NSKVMAXVRE (Handpiece NSKEX6B)
Vannas 弹簧剪刀	Fine Science Tools	15000-03
显微血管剪刀	World Precision Instruments	501790
4-0 Vicryl 缝合线	Ethicon
血管夹及施夹器
手术显微镜	Zeiss
紧凑型单气体异氟烷麻醉系统 K/F	VetTech Solutions
碳钢手术刀片 10 号	Swann-Morton	201
25G 针头	Terumo	NN-2525R
注射器（1 ml 和 5 ml）	Terumo	SS+01T1 / SS*05SE1
生理盐水（0.9% 氯化钠）	Fresenius Kabi	Pl 08828/0178
棉签	Johnson and Johnson	5.00021E+12	使用前灭菌
纱布			使用前灭菌