小鼠脊髓神经元的脱髓鞘与再髓鞘化

摘要

来源：Keough, M. B.，等。通过局部注射溶血卵磷脂对小鼠脊髓进行实验性脱髓鞘与再髓鞘化。J. Vis. Exp. (2015)

本视频展示了使用溶血卵磷脂注射在小鼠脊髓神经元中诱导脱髓鞘的方法，随后通过少突胶质前体细胞的迁移与分化实现再髓鞘化。该过程会暂时损害神经元信号传导，并随后逐步恢复。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 准备注射器以进行注射

1. 将溶血卵磷脂溶解于磷酸盐缓冲液（PBS；pH 7.4）中，配制成1%溶液，并以小份（75 μl）分装后于-20 °C保存。将一支冻存管置于室温（RT）下解冻。
   注意：若溶血卵磷脂未完全溶解，可将管子置于超声波清洗器（40 kHz）中超声约30分钟，以形成均匀溶液。
2. 操作预拉制的玻璃毛细管时需格外小心，避免损伤其精细的尖端。取一支10 μl注射器，拧下螺帽，将其套在毛细管的平头端，随后依次装入两个卡套，确保卡套的对接端对齐，并使毛细管紧密嵌入锥形卡套内（图1）。用异丙醇冲洗注射器并取出推杆。待干燥后，用手将针头组件拧紧至注射器上。
3. 将引注用金属接头针连接至引注注射器。用针头刺穿橡胶垫片并将其滑至底部。向引注注射器中注入溶血卵磷脂。轻压引注注射器活塞，直至针尖处可见液体流出。此步骤可确保不会将气泡引入注射用注射器中。
4. 将引注注射器的金属接头针插入注射用注射器内。确保橡胶垫片形成牢固密封，缓慢推动引注注射器活塞，直至溶液充满毛细管尖端。在缓慢推动的同时小心拔出引注注射器，以避免引入气泡并完成注射器筒身的填充。将推杆插入注射用注射器中，并轻压推杆，确认溶液能从毛细管尖端顺利流出。
   注意：若在毛细管或注射用注射器中观察到任何气泡，则必须从头开始重新制备注射器。注射装置内液体的连续性对于确保精确的注射体积至关重要。
5. 将组装完成的注射用注射器固定至立体定位显微操作臂上。该完整装置在需要重新填充前可连续用于15–20只动物的注射。
6. 弃去引注注射器中剩余的溶血卵磷脂。反复抽吸并推出异丙醇数次，随后拆下金属接头针。等待数小时，待引注注射器内残留的异丙醇完全蒸发后，方可再次填充使用。

2. 手术前准备实验动物

注意：本实验步骤适用于8至10周龄的雌性C57BL/6小鼠。

1. 按照机构动物护理规定，通过腹腔注射氯胺酮（200 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）使动物麻醉。若使用注射麻醉，预计动物麻醉时间约为1小时。
2. 用力捏压动物足部以检测其是否处于深度麻醉状态。正确麻醉的动物对捏压无反应。
3. 使用电推剪在动物背部靠近耳朵处剃除约2–3 cm²的毛发区域。操作时注意避免损伤耳朵。
4. 用浸有70%乙醇的纱布擦拭该区域，确保清除所有剪下的毛发，并用碘液对该区域进行消毒。
5. 在眼睛上涂抹凡士林，以防止手术过程中角膜干燥。
6. 在开始手术前，将动物置于加热的恢复舱中保温。

3. 实施手术操作

注意：确保在操作的每一步骤中均采用充分的无菌技术。这包括正确使用手套、发网、口罩和无菌巾。所有器械在接触动物之前均应进行灭菌处理。

1. 将动物置于立体定位仪中，背侧朝上，用折叠的纸巾在身体中段下方垫高，以增强脊柱的弯曲程度。用手术胶带固定四肢和尾巴，并使用门齿夹固定头部。本操作无需使用耳杆进行稳定。
2. 使用手术刀从耳后下方开始，沿中线向尾侧做一条长约3 cm的切口。
3. 找到两侧大型脂肪组织之间的分界处，双手各持精细镊子将其分开。放置牵开器以充分暴露手术视野。
4. 在手术显微镜下，定位胸椎第2节（T2）椎骨明显的突起结构（注意：该特征为C57BL/6小鼠品系所特有）。使用闭合的弹簧剪刀对覆盖其上的肌肉组织进行钝性分离，以更清晰地暴露T2。用镊子触诊胸椎第3节（T3）和胸椎第4节（T4）的坚硬骨面，确认解剖位置正确。
5. 使用弹簧剪刀在T3与T4之间的结缔组织上做浅层侧向切口（深度约2–3 mm）。由于小鼠上胸段脊柱椎体之间存在自然间隙，无需进行椎板切除即可暴露脊髓。注意切口不宜过深，以免刺破并损伤脊髓。
   注意：此步骤中少量出血较为常见。若发生出血，可用海绵棒轻压出血区域直至止血（30–60秒）。
6. 观察脊髓。若在暴露脊髓过程中尚未切开脑膜层，则脊髓表面将覆盖一层较厚且可见的硬脑膜。一条明显的血管沿脊髓近似中线位置走行，方向为尾侧/头侧。
   注意：不应将该血管作为中线定位标志。应通过充足的照明观察背柱两侧的灰质-白质分界线，并以此估算中线位置。
7. 若硬脑膜仍完整，使用32 G金属针轻轻向侧方刮除，直至清除。目标是去除硬脑膜的同时避免损伤下方较薄且不易观察的其他脑膜结构。
   注意：若出现脑脊液流出，提示蛛网膜已破裂。尽管这可能未造成组织机械性损伤，但仍应使用海绵棒吸除积聚的脑脊液，以便更清楚地观察脊髓表面。
8. 将注射针筒就位，缓慢下放，使毛细管尖端刚好接触脊髓中线两侧紧邻区域的表面。锁定机械臂位置。
9. 利用Z轴立体定位臂的刻度读取基准位置数值，从此数值中减去1.3 mm。以快速而浅表的向下动作刺入组织，并小心降低毛细管至目标深度。可选：如需在背柱制造损伤，可在中线处以相同穿刺动作，插入深度为0.3 mm。
   注意：上述数值适用于T3与T4之间区域的注射。若选择在脊髓其他部位进行注射，需根据现有的小鼠脑图谱重新确定相应参数。
10. 使用显微操作器将溶血卵磷脂注入脊髓腹侧白质。每5秒旋转显微操作器一次，持续2分钟，最终注射体积为0.5 μl。注射完成后保持毛细管原位静置2分钟，防止液体回流，随后小心拔出毛细管。
11. 在覆盖脊柱的肌肉/脂肪组织上打一个结扎缝合线。采用连续缝合法关闭皮肤切口。在切口处再次涂抹碘伏。
12. 将动物放入加热的恢复舱中直至苏醒，然后送回笼具。根据机构动物护理规范给予术后镇痛处理。通常无需额外术后护理，因为动物在麻醉恢复后即可完全自主活动，并能自行进食和饮水。
13. 对剩余动物重复上述操作。
    注意：熟练操作后，每只动物的手术时间可缩短至10–15分钟，尤其在有助手协助缝合的情况下。同一根玻璃毛细管可重复使用约15–20次，直至尖端变钝后需更换。对照组手术可按相同步骤进行，仅将溶血卵磷脂替换为PBS注入脊髓。我们不建议清洗毛细管以供后续使用。

结果

图1. 注射用注射器的组装。 （A）将注射器螺帽旋紧在玻璃毛细管的平端上，随后装入两个卡套，使其对接端相互锁合。当毛细管牢固地嵌入锥形卡套后，将整个组件用手拧紧至注射器末端。（B）用连接在引液注射器上的金属针头刺穿橡胶垫片中心，并将其向下滑至底部。（C）用引液注射器吸取溶血卵磷脂溶液。（D）轻压引液注射器，直至针尖处出现第一滴溶血卵磷脂。（E）将引液注射器插入注射器筒体内，使橡胶垫片形成严密密封。轻轻推动溶液，使其流至毛细管末端。在保持推杆压力的同时，小心拔出引液注射器，以移除金属针头，同时避免向注射器内引入气泡。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
弹簧剪	Fine Science Tools	15004-08
镊子	Fine Science Tools	11254-20
牵开器	Fine Science Tools	17003-03
剪毛剪	Philips	QG3330
加热恢复室	Peco Services	V1200
手术胶带	3M	1527-1
手术刀柄	Fine Science Tools	10003-12
手术刀片	Feather	No. 15
海绵探针	Beaver Visitec	581089
5-0 Vicryl 缝合线	Ethicon	J511G
弯曲 ToughCut 弹簧剪	Fine Science Tools	15123-12
32 号金属针头	BD	305106
持针器	Fine Science Tools	12002-14
弯头镊子	Fine Science Tools	11251-35
棉签	Puritan	806-WC
纱布垫	Safe Cross First Aid	3763
10 μL 注射器	Hamilton	7635-01	请确保购买的是微升级注射器，而非气密型注射器
压缩接头	Hamilton	55750-01	包含两个卡环和可拆卸螺母，但 10 μL 注射器附带的螺母更贴合
引液套件	Hamilton	PRMKIT	包含引液注射器、可拆卸针头和橡胶垫片
预拉制玻璃毛细管	WPI	TIP10TW1（每包 10 根）	包含内径为 10 μm 的毛细管。内径 30 μm 的也可使用（TIP30TW1）
立体定位仪	David Kopf instruments	Model 900
超声波清洗机	Fisher Scientific	FS-20
显微镜载玻片	VWR	48311-703
明场显微镜	Olympus	BX51
溶血磷脂酰胆碱	Sigma	L1381
PBS	Oxoid	BR0014
异丙醇	Sigma	109827
氯胺酮	CDMV
赛拉嗪	CDMV
碘	West Penetone	2021
凡士林软膏	VWR	CA05971