使用高功率激光在指定神经元中诱导靶向性损伤 果蝇 幼虫

摘要

来源：Li, D., Li, F., 等. 一种用于研究外周和中枢神经系统神经再生的果蝇体内损伤模型。J. Vis. Exp. (2018)

本视频演示了一种利用高功率激光在黑腹果蝇（Drosophila）幼虫中诱导靶向神经元损伤的方法。将幼虫置于显微镜下定位后，先使用低功率激光扫描荧光标记的神经元，随后提高激光功率以诱导局部损伤。通过观察损伤部位荧光增强及形成凹坑来确认损伤效果。

方案

1. 双光子损伤与共聚焦成像

1. 显微镜设置
   注意：本实验使用配备双光子激光器的共聚焦激光扫描显微镜，但其他具有类似配置的系统也可适用。双光子激光（930 nm）用于造成损伤，氩离子激光（488 nm）用于GFP的共聚焦成像。
   1. 每次实验开始时，打开双光子激光器和/或共聚焦激光器以及显微镜，然后启动成像软件。
   2. 进行双光子损伤时，使用930 nm（1,950 mW）双光子激光对GFP成像，设置以下参数：
      1. 选择线扫描模式。将针孔完全打开。将激光强度提高至约20%（390 mW）。
      2. 选择512 x 512作为帧扫描尺寸。使用最大扫描速度（通常像素驻留时间为0.77 µs）。确保平均次数为1，位深度为8位。
      3. 将增益设为约750，偏移设为0。
      4. 将此预设实验方案保存为2P GFP 930 Ablation，以便在后续实验中方便重复使用。
   3. 进行共聚焦成像时，使用488 nm氩离子激光对GFP成像，设置以下参数：
      1. 选择采集选项卡，然后选择Z堆栈。
      2. 在“激光”下，开启4....

结果

图 1：外周区域中 da 类神经元轴突再生表现出类别特异性。（A 和 B）显示幼虫位置的示意图。（C）III 类 da 神经元的示意图。（D）标记为 19-12-Gal4, UAS-CD4-tdGFP, repo-Gal80/+ 的 III 类 da 神经元 ddaF 的轴突无法再生。（E）IV 类 da 神经元的示意图。（F）标记为 ppk-CD4-tdGFP/+ 的 IV 类 da 神经元 v'ada 的轴突能够越过损伤部位再生。（D 和 F）红线表示轴突长度，绿色虚线表示细胞体与轴突汇聚点之间的距离（DCAC）。蓝色圆点标记轴突汇聚点。比例尺 = 20 µm。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙醚，ACS级试剂，无水	Acros Organics	AC615080010
Halocarbon 27 油	Genesee Scientific	59-133
磷酸盐缓冲液（PBS），20倍浓缩液，pH 7.5，供应商货号 E703-1L	VWR	97062-948
琼脂粉，Alfa Aesar，500克	VWR	AAA10752-36
葡萄汁	Welch's
乙醇 95%（试剂级乙醇 95%）	VWR	64-17-5
乙酸	Sigma-Aldrich	A6283
丙酸	J.T.Baker	U33007
盖玻片：矩形	Fisher Scientific	12-544-D	50 mm × 22 mm
蔡司 LSM 880 激光扫描显微镜	Zeiss
Zen 软件	Zeiss
Chameleon Ultra II	Coherent