使用高功率激光在指定神经元中诱导靶向性损伤 果蝇 幼虫

摘要

来源：Li, D., Li, F., 等. 一种用于研究外周和中枢神经系统神经再生的果蝇体内损伤模型。J. Vis. Exp. (2018)

本视频演示了一种利用高功率激光在黑腹果蝇（Drosophila）幼虫中诱导靶向神经元损伤的方法。将幼虫置于显微镜下定位后，先使用低功率激光扫描荧光标记的神经元，随后提高激光功率以诱导局部损伤。通过观察损伤部位荧光增强及形成凹坑来确认损伤效果。

方案

1. 双光子损伤与共聚焦成像

1. 显微镜设置
   注意：本实验使用配备双光子激光器的共聚焦激光扫描显微镜，但其他具有类似配置的系统也可适用。双光子激光（930 nm）用于造成损伤，氩离子激光（488 nm）用于GFP的共聚焦成像。
   1. 每次实验开始时，打开双光子激光器和/或共聚焦激光器以及显微镜，然后启动成像软件。
   2. 进行双光子损伤时，使用930 nm（1,950 mW）双光子激光对GFP成像，设置以下参数：
      1. 选择线扫描模式。将针孔完全打开。将激光强度提高至约20%（390 mW）。
      2. 选择512 x 512作为帧扫描尺寸。使用最大扫描速度（通常像素驻留时间为0.77 µs）。确保平均次数为1，位深度为8位。
      3. 将增益设为约750，偏移设为0。
      4. 将此预设实验方案保存为2P GFP 930 Ablation，以便在后续实验中方便重复使用。
   3. 进行共聚焦成像时，使用488 nm氩离子激光对GFP成像，设置以下参数：
      1. 选择采集选项卡，然后选择Z堆栈。
      2. 在“激光”下，开启488 nm氩离子激光的电源。
      3. 进入通道，选择488 nm激光，并将激光功率提高至5-10%。针孔使用1-2艾里单位（AU）。将增益调整至650。
      4. 在采集模式中，选择1024 x 1024作为帧扫描尺寸，使用最大扫描速度，平均次数为2，位深度为8位。
      5. 将此预设实验方案保存为GFP(绿色荧光蛋白)成像。
2. 幼虫麻醉与固定（使用乙醚）
   1. 在通风橱中，将一个60 mm玻璃培养皿放入15 cm塑料培养皿内。在玻璃培养皿底部折叠并放置一张滤纸，然后将一块葡萄汁琼脂板置于滤纸上。向玻璃培养皿中加入乙醚，直至滤纸完全浸透且皿底留有一层液态乙醚。操作过程中始终盖上盖子。
   2. 准备一张载玻片，在中央滴加一滴卤碳油27。在载玻片四角各加一小点真空脂，用于后续支撑盖玻片。
   3. 用镊子夹取一只清洁的幼虫，将其放置在60 mm玻璃培养皿中的琼脂板上。盖上培养皿盖，等待幼虫停止运动。进行外周神经系统（PNS）损伤/成像时，一旦幼虫尾部停止抽动即取出；进行中枢神经系统（CNS）操作时，需等待整个幼虫完全静止，尤其是头部节段。
      注意：乙醚暴露时间至关重要。参见讨论部分。
   4. 小心夹起麻醉后的幼虫，使其头部朝上放入载玻片的卤碳油滴中。将盖玻片覆盖在载玻片上。轻轻按压盖玻片，直至其接触幼虫（图1A）。
   5. 通过轻推盖玻片向左或向右滚动幼虫，调整其位置，使目标神经元/轴突/树突位于上方并最接近显微镜物镜。
   6. 进行PNS损伤时，将幼虫背侧朝上固定，使两侧气管可见。然后将幼虫向左旋转约30度以损伤III类da神经元轴突（图1B 和1C），旋转90度以损伤IV类da神经元轴突（图1B 和1E），或旋转约30度以损伤IV类da神经元树突。
   7. 进行CNS损伤时，将幼虫完全腹侧朝上放置，使感兴趣区域在z轴平面上最接近显微镜物镜。
3. 双光子激光损伤
   1. 将载有幼虫的载玻片置于显微镜下，并用载物台上的夹具固定。使用10X（0.3 NA）物镜找到幼虫。
   2. 在盖玻片上滴加一滴镜油，切换至40X（1.3 NA）物镜并调节焦距。
   3. 切换至扫描模式，并重新使用实验方案2P GFP 930 Ablation。确保针孔完全打开。
      注意：具体配置需根据各系统进行优化。
   4. 启动实时模式以定位感兴趣区域（ROI），并微调设置，在适当放大倍数下获得良好的图像质量。
      注意：此步骤的目的是定位待损伤的神经元/轴突/树突，而非获取最佳图像质量。因此，应使用足以观察目标区域的最低设置，以避免过度曝光或光漂白。
   5. 停止实时扫描，使裁剪按钮可用。以静止图像作为参考图，选择裁剪功能，并调整扫描窗口以聚焦于待损伤目标。
   6. 将ROI缩小至预期损伤位点的大小。例如，仅覆盖轴突或树突的宽度，以确保损伤的精确性并减少对邻近组织的损伤。如需要，可在裁剪前对ROI进行放大，以实现更精确的损伤。
   7. 打开新的成像窗口。降低扫描速度并提高激光强度。激光强度的提升幅度应基于实时模式下扫描获得的组织荧光信号来确定。
   8. 通常，PNS损伤时双光子激光强度从25%开始，VNC损伤时为50-100%。对于PNS轴突损伤，确保激光强度约为480 mW，像素驻留时间为8.19 μs。对于VNC轴突损伤，激光强度和像素驻留时间通常分别为965-1930 mW和8.19-32.77 μs。
   9. 启动连续扫描。将光标悬停在连续按钮上。密切观察图像，一旦观察到荧光显著增强，立即停止扫描。
      注意：荧光信号的突然升高是由于损伤部位的自发荧光所致。
   10. 通过重新应用设置切换回实时模式。通过调节焦距，找到刚刚被靶向的感兴趣区域。
       注意：成功损伤的良好标志是在损伤部位出现微小凹坑、环状结构或局部碎片。
   11. 移动至下一个神经元，从步骤1.3.5开始重复操作，以在同一动物体内损伤多个神经元。或者，若初始损伤不足，可重复步骤3.3.5，逐步提高激光功率和/或降低扫描速度。
       注意：若激光功率过高，损伤后实时扫描图像中将可见大面积损伤区域。过度损伤可能导致幼虫死亡。
   12. 小心移除盖玻片，将受伤幼虫转移至含有酵母糊的新培养板上。用镊子在琼脂板上挖出若干小洞；或者，在培养板中制作一个琼脂岛而非使用整块琼脂，以减少幼虫爬出培养板的可能性。
   13. 将培养板放入60 mm培养皿中，并加入湿润滤纸（用0.5%丙酸溶液浸泡），在室温或25°C下培养。
       注意：与25°C相比，幼虫在室温（22°C）下将额外多保持约一天的幼虫阶段。

结果

图 1：外周区域中 da 类神经元轴突再生表现出类别特异性。（A 和 B）显示幼虫位置的示意图。（C）III 类 da 神经元的示意图。（D）标记为 19-12-Gal4, UAS-CD4-tdGFP, repo-Gal80/+ 的 III 类 da 神经元 ddaF 的轴突无法再生。（E）IV 类 da 神经元的示意图。（F）标记为 ppk-CD4-tdGFP/+ 的 IV 类 da 神经元 v'ada 的轴突能够越过损伤部位再生。（D 和 F）红线表示轴突长度，绿色虚线表示细胞体与轴突汇聚点之间的距离（DCAC）。蓝色圆点标记轴突汇聚点。比例尺 = 20 µm。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙醚，ACS级试剂，无水	Acros Organics	AC615080010
Halocarbon 27 油	Genesee Scientific	59-133
磷酸盐缓冲液（PBS），20倍浓缩液，pH 7.5，供应商货号 E703-1L	VWR	97062-948
琼脂粉，Alfa Aesar，500克	VWR	AAA10752-36
葡萄汁	Welch's
乙醇 95%（试剂级乙醇 95%）	VWR	64-17-5
乙酸	Sigma-Aldrich	A6283
丙酸	J.T.Baker	U33007
盖玻片：矩形	Fisher Scientific	12-544-D	50 mm × 22 mm
蔡司 LSM 880 激光扫描显微镜	Zeiss
Zen 软件	Zeiss
Chameleon Ultra II	Coherent