来源：Aulston, B.，等。利用慢病毒介导的人类神经元转导研究 Tau 蛋白聚集的体外模型
本视频展示了利用编码突变型人源tau蛋白并标记黄色荧光蛋白（YFP）的慢病毒转导人神经元细胞，以研究蛋白聚集的过程。该方法详细阐述了从病毒进入细胞到突变型tau蛋白表达的各个步骤，最终在神经元中形成可见的细胞质tau蛋白聚集体。
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方法文章
慢病毒介导的人类神经元转导用于 Tau 蛋白聚集分析
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2025年7月8日
本文内容
摘要
方案
1. 培养基与试剂的准备
- 在 4 °C 下解冻用于培养板的基底膜基质涂层（切勿让基底膜基质升温，否则会凝固）。分装成 1 mL 等份，于 -20 °C 或 -70 °C 保存。
- 将碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）重悬至 10 μg/mL，并分装为 10 μL 等份，于 4 °C 保存。
- 向一个新开封的 500 mL 含谷氨酰胺的 DMEM/F12 培养基中加入 B27（10 mL）、N2（5 mL）和青霉素-链霉素（5 mL）。取 50 mL 此神经干细胞（NSC）培养基至锥形管中，加入 10 μL 的 10 μg/μL bFGF（终浓度为 2 μg/mL）。将添加 bFGF 的 NSC 培养基（NSC (+) bFGF）于 4 °C 保存。
- 制备不含 bFGF 的培养基（(-) bFGF 培养基）时，采用与步骤 1.3 相同的配方，但不添加 bFGF。该培养基将用于诱导神经干细胞向神经元分化，并在分化后维持神经元培养。
2. 慢病毒载体构建
注意：在开始使用慢病毒载体之前，须确保实验室已获得使用生物安全二级（BSL-2）试剂的批准。此外，操作慢病毒载体时，必须使用生物安全二级（BSL-2）的细胞培养柜、个人防护装备（PPE）以及相应的废弃物处理方法。
- 从首选来源获取包装在慢病毒中的 Tau 载体。
3. 培养人类神经干细胞
注意： NSCs 通常以每平方厘米 100,000–150,000 个细胞的密度接种2 且大多数市售的NSCs以1 x 10出售6 每管细胞。本实验方案已针对10 cm细胞培养皿进行优化（尽管也可使用其他规格的培养皿）；因此，若使用 commercially available NSCs（商品化神经干细胞），可能需要先在6孔板中进行扩增培养，以获得足够数量的细胞用于接种10 cm培养皿。本方案亦可根据多种规格的细胞培养皿进行相应调整。
- 准备细胞培养板时，取出一份冻存的基底膜基质涂层，置于 4 °C 下解冻（可在接种细胞的前一天晚上将分装样品置于 4 °C 过夜）。将 385 μL 基底膜基质涂层加入 5 mL DMEM/F12 培养基 + 青霉素-链霉素中。
注意：5 mL DMEM/F12 培养基 + 青霉素-链霉素足以包被一个 10 cm 培养皿（该基底膜基质包被液 1 mL 可包被六孔板的一个孔）。或者，若细胞需进行固定和免疫染色，或硫黄素染色，则将细胞培养于 24 孔板中的玻璃盖玻片上。- 在将培养基和基质涂层加入培养皿前及过程中，均应保持其低温状态。将基底膜基质涂层加入培养皿后，置于 37 °C 培养箱中孵育 1 小时。为获得最佳包被效果，孵育时间不得超过或少于 1 小时。1 小时后，吸除细胞培养皿中的基底膜基质涂层。确保此步骤与神经干细胞（NSCs）准备接种的时间同步。
注意：若细胞非从冻存状态复苏，则跳过步骤 3.2，继续进行步骤 3.3。
- 在将培养基和基质涂层加入培养皿前及过程中，均应保持其低温状态。将基底膜基质涂层加入培养皿后，置于 37 °C 培养箱中孵育 1 小时。为获得最佳包被效果，孵育时间不得超过或少于 1 小时。1 小时后，吸除细胞培养皿中的基底膜基质涂层。确保此步骤与神经干细胞（NSCs）准备接种的时间同步。
- 若从冻存的神经干细胞（NSC）库存中复苏细胞，取一管冻存细胞，在 37 °C 水浴中通过来回移动使其快速升温。解冻后，用 70% 乙醇喷洒管体，并将其转移至细胞培养超净台。将细胞转移至约 10 mL DMEM/F12 + 青霉素-链霉素培养基中，在室温下以 1,000 × g 离心 5 分钟。吸除上清液，将细胞重悬于 NSC 培养基中。
- 用 NSC 培养基稀释细胞，以获得适用于所用细胞培养容器的合适接种密度。
注意：例如，若将神经干细胞（NSCs）接种至六孔板中——六孔培养板每孔表面积为 9 cm2——需接种 900,000 至 1,350,000 个细胞。因此，含有 1,000,000 个细胞的一管细胞可重悬于 2 mL 培养基中，加入六孔板的一个孔内。 - 将适量悬浮于 NSC 培养基中的细胞接种至已包被基底膜基质的培养皿中（接种密度为 100,000 个细胞/cm2），并每隔一天更换一次培养基（若使用冻存细胞，接种后次日更换培养基，之后每隔一天更换一次）。培养细胞至其融合度达到 75%–80%。
注意：细胞在接种后不久可能即达到 75%–80% 融合度，但若使用冻存细胞，可能需要更长时间。 - 当神经干细胞（NSCs）融合度达到 75%–80% 时，开始神经元分化：移除含 bFGF 的 NSC 培养基（NSC (+) bFGF），更换为不含 bFGF 的 NSC 培养基（NSC (-) bFGF）。在此培养基中继续培养细胞（每隔一天更换一次培养基），至少持续 4 周。
注意：撤除 bFGF 后，细胞仍会继续分裂数天；因此，细胞融合度可能达到 90–100%。 - 培养 4 周后，细胞将已获得神经元命运，可进行慢病毒处理。
4. 神经元培养物的转导与维持
- 使用慢病毒转导神经元时，采用每细胞 3.4 × 105 可转导单位的滴度（一个100%汇合的10 cm培养皿约含有1000万个神经元）。将可转导单位用细胞培养基稀释至所需浓度后加入细胞中（使用细胞培养皿的常规培养基体积）。加入慢病毒两天后，用新鲜的不含bFGF培养基（不含慢病毒）洗涤细胞一次，并继续在不含bFGF培养基中常规培养。
- 慢病毒转导后的处理：每隔一天更换一次细胞培养基（[-] bFGF培养基）以喂养转导后的神经元。转导后维持细胞培养约8周。定期在光学显微镜下观察细胞，以确保其存活状态。
注意：细胞稀疏或树突断裂是细胞失去活性的征象。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10 cm 培养皿 | Thermofisher | 12556002 | |
| 50 mL 离心管 | Biopioneer | CNT-50 | |
| 喷瓶中的 70% 乙醇 | 多种来源 | NA | |
| B27 添加剂 | Thermofisher | 17504044 | |
| 基底膜基质（Matrigel） | Corning | 356231 | |
| 碱性成纤维细胞生长因子（basic FGF） | Biopioneer | HRP-0011 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma | A7906 | |
| 细胞培养孵育箱 | 多种来源 | NA | |
| 离心机 | 多种来源 | NA | |
| 含谷氨酰胺的 DMEM-F12 培养基 | Thermofisher | 10565042 | |
| 乙醇（浓度 50% 或更高） | 多种来源 | NA | |
| 人神经干细胞 | 多种来源 | NA | |
| 慢病毒载体 | 多种来源 | 定制订单 | |
| N2 添加剂 | Thermofisher | 17502048 | |
| 青霉素-链霉素 | Thermofisher | 15140122 | |
| 磷酸盐缓冲液 | Thermofisher | 14190250 | |
| 无菌细胞培养操作台 | 多种来源 | NA | |
| 水浴锅 | 多种来源 | NA |
