建立自体血注射诱导的蛛网膜下腔出血大鼠模型

摘要

来源：Bömers, J. 等. 大鼠模型中通过视交叉前单次注射自体血诱导实验性蛛网膜下腔出血. J. Vis. Exp. (2021)

本视频演示了建立蛛网膜下腔出血大鼠模型的操作步骤。对麻醉后的大鼠植入探针，用于测量颅内压和脑血流量。确定目标位置后，将针头插入视交叉前位置。随后将自体血注入蛛网膜下腔，导致颅内压升高、脑血流量下降，从而成功建立模型。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 准备工作

1. 改造16 G外周静脉导管用于插管。改造方法：将针头缩短1 cm，并将剩余远端1 cm部分向注射阀方向弯曲30°。拆除导管翼（可重复使用）。
2. 制作颅内压（ICP）探头时，取一段20 mm长的聚乙烯管（内径（ID）：0.58 mm，外径（OD）：0.96 mm），烧灼一端形成圆形板状结构，同时保持管腔开放。在聚乙烯管周围包裹1 mm长的硅胶管（内径（ID）：1.0 mm，外径（OD）：3.0 mm），然后将一段10 mm长的硅胶管（内径（ID）：0.76 mm，外径（OD）：2.4 mm）连接至聚乙烯管的末端。
3. 打开笔记本电脑并启动数据采集软件。根据制造商的说明对血压（BP）和颅内压（ICP）换能器以及激光多普勒进行校准。
4. 准备血气分析仪设备。
   注意： 确保异氟烷挥发罐中有足够的异氟烷。
5. 打开 O₂ 和大气气流。设置O的流量₂ 30% 氧气和70% 大气空气
6. 将加热垫放置到位，并将温度设置为 37 °C。

2. 麻醉

1. 将大鼠放入麻醉室，通入30%的O₂和70%的大气空气。向室内注入5%的异氟烷气体，充分麻醉约需4分钟。密切观察呼吸情况。
2. 麻醉后，将大鼠仰卧位固定于一块重板上，重板周围设有橡皮带，将大鼠的门齿置于橡皮带下方。
3. 用弯头镊子小心拉出舌头，用棉签清洁喉部。在咽喉正中位置放置外部光源，以清晰观察声带。
4. 在吸气相使用改良的16 G外周静脉导管进行气管插管。正确插入后，取出导丝，将导管连接至呼吸机。
   注意：通过胸廓运动是否与呼吸频率同步来确认导管位置正确。若观察到腹部运动，应立即拔管，并将大鼠重新放入麻醉罩中。由于可能损伤气道，该操作不应重复超过三次。
5. 插管成功后，以30%的O₂和70%的大气空气维持人工通气，异氟烷麻醉维持在1.5%–3%。根据血压调整异氟烷浓度，使血压保持在80–100 mmHg之间。
6. 将呼吸机的吸气潮气量设定为3 mL，频率设定为40–45次/分钟。根据血气分析结果调整吸气潮气量。
7. 使用2-0缝线穿过颊部内侧软组织进行缝合，将缝线缠绕在注射管及外周静脉导管的注射阀上，以固定导管。
8. 将大鼠转移至手术区域，保持仰卧位，尾部朝向术者。
9. 必要时涂抹眼用凝胶，防止眼睛干燥。
10. 进行足趾夹捏测试，确认麻醉深度适宜。在手术过程中持续评估并维持适当的麻醉深度。

3. 尾部导管

1. 用0.5%氯己定乙醇消毒尾部近端3-4 cm区域。
   注意：从此时起，根据术者判断使用手术显微镜。
2. 在尾部近端腹侧做15-20 mm的皮肤切口。注意不要切到动脉。
3. 使用弯头镊子将皮肤从下方结缔组织上分离。
4. 小心穿透筋膜，暴露动脉。
5. 使用弯头镊子小心地将尾动脉从下方组织中游离出来。
6. 将三根黑色丝线穿入血管下方。将其中一根线尽可能向远端放置，并在动脉周围打紧外科结。用止血钳夹住线的游离端。
7. 将另外两根线松松地绕在动脉周围。
8. 将近端的线尽可能向近端推移。用止血钳夹住该线的两端，轻轻牵拉，足以限制并阻断血流。将止血钳放置于腹部固定。
9. 将导管尖端以45°角斜剪。剪去尖锐部分，以防刺破动脉壁。
10. 使用Vannas剪刀，在距远端结扎线3-5 mm处，以30°角做动脉切口，切口直径约为动脉直径的1/3。
11. 使用两把直镊子将导管插入动脉。一把镊子夹住导管，另一把镊子小心地将动脉拉至导管上。
12. 将导管沿血管向近端推进至近端结扎线处，松开止血钳上的结扎线。观察导管内的血流情况。将中间的线松松地固定在导管上。
13. 继续插入导管，尽可能达到甚至略微超过动脉再次被筋膜覆盖的位置。
14. 通过生理盐水冲洗来确认导管位置是否正确以及是否存在渗漏。
15. 使用外科结扎法扎紧两根近端丝线。
    注意：血压测量必须呈搏动性；若无搏动，则表明导管位置不当。
16. 使用远端丝线在切口末端打外科结，固定导管。
17. 用两针不可吸收单股4-0缝线松松缝合皮肤切口。注意不要刺穿导管。
    注意：整个手术过程中应注意搏动幅度。若搏动较弱，应用生理盐水冲洗导管。
18. 将动脉导管从压力换能器上松开，以允许血液流出用于血气采样。将微毛细管置于导管末端，使血液流入管内。采血后重新连接导管至换能器，并冲洗导管。
19. 将毛细管插入血气分析仪。测定pH、pCO₂和pO₂，并记录结果
    ​注意：根据血气和血压数值调整通气频率。若平均动脉压（MAP）过低，可尝试降低异氟烷的流量。检测反射以确认麻醉深度是否合适。

4. ICP 探针

1. 将大鼠置于立体定位仪框架中。确保大鼠对称放置非常重要。
2. 在立体定位仪框架下方放置一个圆柱形垫枕，以使颈部产生前屈。
3. 剃除大鼠头皮、颈部及耳后区域的毛发，并清除多余毛发。
4. 使用0.5%氯己定乙醇溶液对术区进行消毒。
5. 使用0.7 mL浓度为10 mg/5 µg/mL的含肾上腺素利多卡因进行局部麻醉，将针头从颅骨中线尾端刺入，向颈部肌肉注射0.3–0.4 mL，其余药液在前囟周围及其前方皮下注射。
6. 从中线针刺点开始，向尾侧做长约8 mm的皮肤切口。
7. 逐层钝性分离所有肌肉组织，以辨认枕寰膜（位于颅骨中线尾侧的大理石样三角区域）。
8. 使用Alm牵开器固定颈部肌肉组织，必要时将带齿牵开器置于尾侧。
9. 检查无菌颅内压（ICP）探头是否已连接至ICP传感器，用生理盐水冲洗ICP探头，确保探头内无气泡存在。
10. 使用23 G针头切开枕寰膜，制作一个小孔，以便引导ICP探头穿过该膜。
11. 轻柔地将探头经枕寰膜送入，轻轻牵拉探头，确认其显示0–5 mmHg范围内的搏动性波形。若未见搏动波形，应撤出探头，检查与传感器的连接，并确认管腔通畅。
12. 滴加两滴组织胶，将1 mm硅胶管向前推进至膜处，并额外添加组织胶，以降低ICP探头移位的风险。
13. 移除牵开器。
14. 使用不可吸收单股4-0缝线，在切口头端缝合一针水平褥式缝合，在尾端缝合一针间断单纯缝合。

5. 针头与激光多普勒探头的放置

1. 在眼睛前方中线处做一切口，向尾侧延伸15 mm。
2. 用镊子去除结缔组织和肌肉。使用无菌棉签的末端作为棉棒，以帮助识别前囟和冠状缝。
3. 放置阿尔姆拉钩。
4. 将25 G脊髓针置于立体定位仪框架上。将针尖精确置于前囟处，并记录位置。
   注意：将立体定位仪框架的中线关节在垂直平面上向动物方向倾斜30°。
5. 将针从前囟处移开，将框架向前移动65 mm，然后将针重新置于中线位置，以标记钻孔位置。
6. 钻孔直至在骨下方识别出硬脑膜。用直头镊子轻轻移除骨碎片，并用骨蜡填充骨腔。
7. 在前囟右侧3–4 mm、冠状缝稍前方处钻另一个孔，用于放置激光多普勒探头。无需完全穿透颅骨，注意切勿损伤硬脑膜。
8. 寻找适合激光多普勒测量血流的血管位置。放置激光多普勒探头并检查读数，要求最小值不低于100 FU。
9. 若读数仍可接受，滴加一滴胶水固定探头。
10. 重新检查确认读数是否高于80 FU。若读数低于80 FU，则需取出并重新调整探头位置，直至读数超过80 FU。
    ​注意：FU为任意单位，用于表示脑血流量（CBF）。

6. 诱导蛛网膜下腔出血（SAH）

1. 将针头轻柔地沿大脑半球间的中线穿过颅骨，直至感受到颅底阻力。将针头回撤1 mm，以确保其准确地位于视交叉前方的适当位置。
2. 将针头顺时针旋转90°，使针尖朝向右侧，以确保注射血液时分布最均匀。取出针芯（图1）。
3. 平衡15分钟，并调整麻醉深度，使平均动脉血压维持在80–100 mmHg范围内。
4. 进行血气分析，并根据结果相应调整麻醉水平。
5. 使用带有钝头23 G针头的1 mL注射器，从尾部导管中抽取500 µL血液。
6. 用血液填充脊髓穿刺针腔内的死腔，以避免空气注入。从已充满血液的注射器上取下23 G针头，并确认注射器内含有300 µL血液。
7. 将注射器连接至脊髓穿刺针，牢固握住后手动推注血液，使其压力超过平均动脉压（MAP）。
8. 在笔记本电脑上观察颅内压（ICP）急剧升高和脑血流量（CBF）急剧下降。
   注意：为确保手术成功，脑血流量（CBF）应至少持续5分钟低于基线值的50%或更低，参见图2。假手术组大鼠不执行步骤6.1–6.7，因此不将脊髓穿刺针插入脑实质，以最大限度减少可能的自发性出血及医源性脑损伤。

结果

图1：诱导蛛网膜下腔出血（SAH）前实验装置的概览。 从图的上方可见，1）注射针、2）激光多普勒探头和3）颅内压（ICP）探头均已就位。

图 2：鞘内注射后的示例曲线。 红色曲线表示以 mmHg 为单位的...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
16 G 外周静脉导管	BD Venflon	393229	针头缩短，远端 1 cm 弯曲，翼片已移除
麻醉罩/麻醉室	未知
血气分析仪	Radiometer	ABL80
血压（BP）监测仪	Adinstruments	ML117	连接至 Powerlab
弯头镊，12 cm × 3	F.S.T	11001-12	用于麻醉
圆柱形枕头，28 cm × 4 cm	自制		由手术毛巾制成
数据采集硬件	Adinstruments	ML870 Powerlab
数据采集软件	Adinstruments	LabChart 6.0
钻机	KMD	1189
钻机控制器	Silfradent	300 IN
柔性光源	Schott	KL200
加热垫	Minco	1135
皮下注射针头，20 G	KD Medical	301300	连接至立体定位仪
颅内压（ICP）监测仪	Adinstruments	ML117	连接至 Powerlab
异氟烷蒸发器	Ohmeda	TEC3
笔记本电脑	Lenovo	T410
激光多普勒监测仪	Adinstruments	ML191
激光多普勒探头	Oxford Optronics	MSF100XP	连接至激光多普勒监测仪
持针器，13 cm	F.S.T	12001-13	用于麻醉
精密注射器，0.025 mL	Hamilton	547407
立体定位仪	Kopf Instruments	M900
手术显微镜	Carl Zeiss	F170
缝合针	Allgaier	1245	用于麻醉
温度控制器	CWE,INC.	TC-1000
换能器 × 2	Adinstruments	MLT0699	连接至血压和颅内压监测仪
呼吸机	Ugo Basile	7025
兽用剪毛器	Aesculap	GT421
三齿 Blair 拉钩，13.5 cm	Agnthos	17022--13
钝头 Alm 拉钩	F.S.T	17008-07
弯头镊，12 cm × 2	F.S.T	11001-12
持针器，13 cm	F.S.T	12001-13
直头 Dumont 镊，11 cm	F.S.T	11252-00
直头 Halsted-Mosquito 止血钳 × 2	F.S.T	13008-12
直头 Iris 剪，9 cm	F.S.T	14090-09
直头 Vannas 剪，10.5 cm	F.S.T	15018-10
可吸收棉片	Kettenbach	31603
黑色丝线，4-0，5 × 15 cm	Vömel	14757
骨蜡	Aesculap	1029754
卡波姆眼用凝胶 2 mg/g	Paranova
棉签	Heinz Herenz	WA-1
棉签棒 × 4	Selefa	120788
皮下注射针头，23 G × 2	KD Medical	900284	连接至三通阀，移除远端
皮下注射针头，23 G × 3	KD Medical	900284	移除远端，2 个连接至三通阀，1 个连接至注射器
颅内压（ICP）探头：	自制		由以下材料制成：
聚乙烯管，20 mm	Smiths medical	800/100/200	内径（ID）：0.58 mm，外径（OD）：0.96 mm
硅胶管，10 mm	Fisher	15202710	ID：0.76 mm，OD：2.4 mm
硅胶管，2 mm	Fisher	11716513	ID：1.0 mm，OD：3.0 mm
微量毛细管离心管	Brand	7493 11
手术巾，45 cm × 75 cm	Mölnlycke	800430
PinPort 接头，22 G	Instech	PNP3F22
PinPort 注射器	Instech	PNP3M
聚乙烯管，2 × 20 cm	Smiths medical	800/100/200	连接至注射器，ID：0.58 mm，OD：0.96 mm
橡皮筋	未知
手术刀，10 号刀片	Kiato	23110
脊髓穿刺针，25 G × 3.5''	Braun	5405905-01
三通阀系统，Discofix × 2	Braun	16494C	连接至换能器
缝线，4-0，单股，不可吸收 × 3	Ethicon	EH7145H
注射器，1 mL	BD Plastipak	1710023
注射器，鲁尔锁，10 mL × 4	BD Plastipak	305959	连接至换能器
组织粘合胶	3M	1469SB
0.5% 氯己定乙醇溶液	Faaborg Pharma	210918
卡洛芬 50 mg/mL	ScanVet	43715	稀释 1:10
异氟烷	Baxter
等渗盐水	Amgros	16404
利多卡因-肾上腺素 10 mg/5 µg/mL	Amgros	16318