使用流式细胞术测量神经元中的多个线粒体参数

摘要

来源：Liang, K. X., 等 人类诱导多能干细胞及其神经和胶质衍生物中多种线粒体参数的流式细胞术分析。J. Vis. Exp. (2021)

本视频展示了使用抗体对神经元细胞的线粒体呼吸链复合物、线粒体DNA相关蛋白以及线粒体外膜蛋白进行标记，随后通过流式细胞术定量其表达水平。

方案

1. 固定细胞中线粒体呼吸链（MRC）复合物亚基和线粒体转录因子A（TFAM）的流式细胞术检测

1. 培养期结束后，加入细胞解离试剂使细胞脱落（约10⁶个），然后在15 mL离心管中离心收集细胞。用磷酸盐缓冲液（PBS）（1×）洗涤细胞，300 × g离心5 min，重复洗涤两次。
2. 在室温下用1.6%多聚甲醛（PFA）（15 mL管中加入1 mL 1.6% PFA）固定细胞10 min。随后以PBS（1×）洗涤细胞，300 × g离心5 min，重复洗涤两次。
3. 加入预冷的90%甲醇（15 mL管中加入1 mL 90%甲醇），在-20 °C条件下对细胞进行透化处理，持续20 min。
4. 用封闭缓冲液（含0.3 M甘氨酸、5%山羊血清和1%牛血清白蛋白（BSA）-第五组分的PBS（1×）溶液）在15 mL管中封闭样本（每管加入1 mL封闭缓冲液）。用PBS（1×）洗涤细胞两次，每次均通过离心完成。
5. 加入以下一抗溶液，孵育30 min：抗NDUFB10抗体（1:1,000）用于检测复合物I亚基，抗琥珀酸脱氢酶复合物黄素蛋白亚基A（SDHA，1:1,000）用于检测复合物II亚基，抗COX IV抗体（1:1,000）用于检测复合物IV亚基，以及与Alexa Fluor 488偶联的抗TFAM（线粒体转录因子A）抗体（1:400）。另取相同数量的细胞，单独与Alexa Fluor 488标记的抗TOMM20（线粒体外膜转位酶20）抗体（1:400）在15 mL管中避光孵育30 min（每管加入1 mL一抗溶液；有关抗体详细信息，请参见材料表）。
6. 用PBS（1×）洗涤细胞一次，300 × g离心5 min。向NDUFB10、SDHA和COX IV对应的离心管中加入二抗（1:400），并孵育30 min。
7. 用PBS（1×）洗涤细胞一次，300 × g离心5 min。吸除上清液，每管中残留约100 µL。将细胞沉淀重悬于300 µL PBS（1×）中，转移至置于冰上并避光的1.5 mL微量离心管中。
8. 使用流式细胞仪（配备3个蓝色激光和1个红色激光）进行检测，通过530/30带通滤光片在FL1通道中采集信号。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Alexa Fluor 488 标记的抗 TFAM 抗体	Abcam	ab198308	一抗；使用比例为 1:400，即 1000 μL 染色液中加入 2.5 μL；使用小鼠单克隆 IgG2b Alexa Fluor® 488 作为同型对照。
Alexa Fluor 488 标记的抗 TOMM20 抗体	Santa Cruz Biotechnology	Cat# sc-17764 RRID:AB_628381	一抗；使用比例为 1:400，即 1000 μL 染色液中加入 2.5 μL；使用小鼠单克隆 IgG2a Alexa Fluor® 488 作为同型对照。
抗 NDUFB10 抗体	Abcam	ab196019	一抗；使用比例为 1:1000，即 1000 μL 染色液中加入 1 μL；二抗使用 Alexa Fluor® 488 标记的山羊抗兔 IgG（1:400，Thermo Fisher Scientific，货号 A-11008）；使用兔单克隆 IgG 作为同型对照。
抗 SDHA 抗体	Abcam	ab137040	一抗；使用比例为 1:1000，即 1000 μL 染色液中加入 1 μL；二抗使用 Alexa Fluor® 488 标记的山羊抗兔 IgG（1:400，Thermo Fisher Scientific，货号 A-11008）；使用兔单克隆 IgG 作为同型对照。
抗 COX IV 抗体	Abcam	ab14744, RRID:AB_301443	一抗；使用比例为 1:1000，即 1000 μL 染色液中加入 1 μL；二抗使用 Alexa Fluor® 488 标记的山羊抗小鼠 IgG（1:400，Thermo Fisher Scientific，货号 A-11001）；使用小鼠单克隆 IgG 作为同型对照。
PBS 1x	Thermo Fisher Scientific	18912014	用于洗涤步骤
甲醛（PFA）16%	Thermo Fisher Scientific	28908	用于细胞固定
甘氨酸	Sigma-Aldrich	G8898	用于封闭缓冲液
牛血清白蛋白	Europa Bioproducts	EQBAH62-1000	封闭剂，用于免疫染色实验中防止抗体非特异性结合，同时也是 CDM 的组分