使用流式细胞术测量神经元中的多个线粒体参数

Abstract

来源：Liang， K. X.， et al. 人诱导多能干细胞及其神经和神经胶质衍生物中多个线粒体参数的流式细胞术分析。J. Vis. Exp. （2021）

该视频演示了使用线粒体呼吸链复合物、线粒体 DNA 相关蛋白和线粒体外膜蛋白抗体标记神经元细胞，然后通过流式细胞术定量其水平。

Protocol

1. 固定细胞中 MRC（线粒体呼吸链）复合物亚基和 TFAM（线粒体转录因子 A）的流式细胞术测量

1. 在培养期结束时，通过添加细胞解离试剂分离细胞 （~10⁶）;然后，将细胞沉淀并收集在 15 mL 管中。用磷酸盐缓冲盐水 （PBS） （1x） 离心 2 次，以 300 × g 离心 5 分钟，洗涤细胞。
2. 在室温 （RT） 下将细胞固定在 1.6% 多聚甲醛 （PFA）（15 mL 管中的 1.6% PFA）中 10 分钟。用 PBS （1x） 离心两次，以 300 × g 离心 5 分钟，洗涤细胞。
3. 在 -20 °C 下用冰冷的 90% 甲醇（1 mL 90% 甲醇在 15 mL 管中）透化细胞 20 分钟。
4. 在含有 0.3 M 甘氨酸、5% 山羊血清和 1% 牛血清白蛋白 （BSA） 的封闭缓冲液中封闭样品 - PBS 中的组分 V （1x）（15 mL 管中含有 1 mL 封闭缓冲液）。通过用 PBS （1x） 离心两次来洗涤细胞。
5. 将细胞与以下一抗孵育 30 分钟：用于测量复合物 I 亚基的抗 NDUFB10 （1：1,000），用于测量复合物 II 亚基的抗琥珀酸脱氢酶复合物黄素蛋白亚基 A （SDHA，1：1,000） 和用于测量复合物 IV 亚基的抗 COX IV （1：1,000），以及与 Alexa Fluor 488 偶联的抗 TFAM（线粒体转录因子 A）抗体 （1：400）。用偶联 Alexa Fluor 488 （1：400） 的抗 TOMM20（线粒体外膜 20 转位酶）抗体分别对相同数量的细胞进行染色 30 分钟（15 mL 试管中的 1 mL 一抗溶液;有关抗体的详细信息，请参见材料表）。
6. 用 PBS （1x） 洗涤细胞一次，以 300 × g 离心 5 分钟。将二抗 （1：400） 加入 NDUFB10、SDHA 和 COX IV 试管中，并将细胞与这些溶液孵育 30 分钟。
7. 用 PBS （1x） 洗涤细胞一次，以 300 × g 离心 5 分钟。吸出上清液，在试管中留下约 100 μL。将细胞沉淀重悬于 300 μL PBS （1x） 中。将细胞转移到 1.5 mL 微量离心管中，并在冰上避光保存。
8. 在流式细胞仪上分析细胞（使用 3 个蓝色和 1 个红色激光配置）。使用 530/30 带通滤波器检测滤波器 1 （FL1） 中的信号。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
与 Alexa Fluor 488 偶联的抗 TFAM	Abcam	ab198308	一抗;用量为 1：400,2.5 μL 溶于 1000 μL 染色液中;使用小鼠单克隆 IgG2b Alexa Fluor® 488 作为同种型对照。
抗 TOMM20 抗体与 Alexa Fluor 488偶联	圣克鲁斯生物技术	货号# sc-17764 RRID：AB_628381	一抗;用量为 1：400,2.5 μL 溶于 1000 μL 染色液中;使用小鼠单克隆 IgG2a Alexa Fluor® 488 作为同种型对照。
反NDUFB10	Abcam	ab196019	一抗;以 1：1000 的比例使用 1 μL，溶于 1000 μL 染色液中;使用 Alexa Fluor ® 488 山羊抗兔 IgG（1：400，Thermo Fisher Scientific，目录 # A-11008）作为二抗;使用兔单克隆 IgG 作为同种型对照。
反 SDHA	Abcam中文官网	ab137040	一抗;以 1：1000 的比例使用 1 μL，溶于 1000 μL 染色液中;使用 Alexa Fluor ® 488 山羊抗兔 IgG（1：400，Thermo Fisher Scientific，目录 # A-11008）作为二抗;使用兔单克隆 IgG 作为同种型对照。
反 COX IV	Abcam	ab14744， RRID：AB_301443	一抗;以 1：1000 的比例使用 1 μL，溶于 1000 μL 染色液中;使用 Alexa Fluor ® 488 山羊抗小鼠 IgG（1：400，Thermo Fisher Scientific，目录 # A-11001）作为二抗;使用小鼠单克隆 IgG 作为同种型对照。
PBS 1x	赛默飞世尔科技	18912014	用于洗涤步骤
甲醛 （PFA） 16%	赛默飞世尔科技	28908	细胞固定
甘氨酸	西格玛奥德里奇	G8898	用于封闭缓冲液
牛血清白蛋白	木卫二生物制品	EQBAH62-1000	封闭剂，可防止免疫染色测定中抗体和 CDM 成分