用于测量人细胞中γ-分泌酶活性的荧光素酶检测

摘要

来源：Wang, B., 等，基于细胞的荧光素酶报告基因检测平台中γ-分泌酶介导的淀粉样前体蛋白和Notch切割的定量测定。J. Vis. Exp. (2018)。

本视频演示了利用四环素诱导系统在基因改造的人类细胞中测定 γ-分泌酶活性的操作流程。该过程包括用四环素诱导 APP 基因表达，生成淀粉样蛋白-β 肽段，并激活荧光素酶的产生。随后检测荧光素酶与底物反应所产生的生物发光信号，以此反映 γ-分泌酶的活性。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。 

1. 荧光素酶报告信号的检测，该信号对应于APP-C99的γ-分泌酶切割 (淀粉样前体蛋白-C端99氨基酸片段)

注意：有关 CG（C99-Gal4）细胞生成的详细描述，请参考先前已发表的文献。

1. 将CG细胞（每孔20,000个细胞）以每孔终体积200 μL的培养基接种至96孔微孔板中，培养基成分为Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）加10%胎牛血清（FBS）、5 μg/mL杀稻瘟菌素（blasticidin）、250 μg/mL抗生素（例如，zeocin）和200 μg/mL潮霉素B。
   1. 使用血细胞计数板对细胞进行计数。
   2. 将微孔板转移至加湿的CO₂培养箱中，在37 °C下孵育过夜。
2. 从每孔中移除100 μL培养基。
3. 向每孔加入100 μL含2 μg/mL四环素的培养基，并分别添加0.2%二甲基亚砜（DMSO）、2 μM CL-387,785、2 μM N-[N-(3,5-二氟苯乙酰基-L-丙氨酰)]-S-苯基甘氨酸叔丁酯（DAPT）或其他相关的ErbB1/ErbB2抑制剂。
4. 将处理后的CG细胞在微孔板中于37 °C孵育24小时。
5. 从微孔板每孔中移除150 μL培养基。
6. 向每孔加入50 μL荧光素酶检测试剂（详见材料表）。
7. 将微孔板转移至化学发光微孔板读数仪。
   1. 在室温下轻轻振荡孵育5分钟。
8. 使用化学发光微孔板读数仪中预设的程序检测萤火虫荧光素酶（FL）发出的发光信号。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
VictorLight 发光酶标仪	PerkinElmer	2030-0010
II 级，2 型生物安全柜	Thermo Scientific	1300 系列 A2
CL-387,785	EMD Calbiochem	233100-1MG
DAPT	Merck	565770
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	Thermo Fisher	12100046	生长培养基的主要成分
胎牛血清（FBS）	Thermo Fisher	16000044
杀稻瘟菌素（Blasticidin）	Thermo Fisher	A1113903
Zeocin	Thermo Fisher	R25005
潮霉素 B（Hygromycin B）	Gibco	10687010
血细胞计数板（Hemocytomer）	Sigma-Aldrich	BR717805 Aldrich
96 孔微孔板	Nunc	156545
四环素（Tetracycline）	Sigma	T7660
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma	D2650
Steady-Glo 荧光素酶检测试剂	Promega	E2510
加湿 CO2 培养箱	Revco	Ultima II
T-REx293 细胞系	Invitrogen	R71007
Wallac 1420 软件版本 3.0	PerkinElmer		发光微孔板读数仪的仪器控制软件