用于鉴定小鼠脑切片中蓝斑区域的免疫组织化学方法

摘要

来源：Schmidt, K. 等，小鼠脑内蓝斑核的定位。J. Vis. Exp. (2019)

本实验方案概述了使用免疫组织化学方法在小鼠脑切片中鉴定蓝斑区域。通过使用绿色荧光标记的抗体靶向多巴胺β-羟化酶，可在显微镜下将产生去甲肾上腺素的神经元显示为绿色荧光。

方案

所有涉及动物样本的实验程序均已通过相应的动物伦理审查委员会的审核与批准。

1. 脑切片

1. 通过使用 3% 异氟烷使小鼠固定并麻醉。
   1. 将棉球滴加异氟烷后放入 15 mL 微离心管中，将动物的鼻部置于管口使其吸入异氟烷。通过脚趾夹捏无反应来判断麻醉深度。
2. 将动物仰卧放置，并用 T 形针固定其四肢，以便暴露腹部。
3. 使用手术剪刀剪开动物，剪开腹部皮肤，并继续剪至胸部区域的皮肤。用 T 形针将皮肤固定展开。随后撕裂腹膜至胸部区域。通过打开胸腔并剪断膈肌暴露心脏。
4. 剪开右心房，使血液流出动物体外。将装有 25 号针头的 10 mL 注射器插入左心室，用 10 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）进行灌流。
   注意：灌流液将经体循环流动，并从右心房流出。
5. 取下 10 mL 注射器，换上连接 60 mL 注射器的 25 号针头。通过左心室以 50 mL 冰冷的 4% 多聚甲醛（PFA）进行灌流。
   1. 通过将 10% PFA 溶液用 H₂O 稀释，并将最终的 4% PFA 溶液在 4 °C 下冷却，制备冰冻的 4% PFA 溶液。
6. 分离小鼠头部，并从颅骨中取出脑组织。
   1. 从颈部剪开皮肤，然后剪至眼部以暴露颅骨。从颈部向鼻部方向敲裂颅骨，再从一侧眼球向另一侧眼球方向敲裂。剥离颅骨，完整取出整个脑组织。
7. 将脑组织在 4% PFA 中 4 °C 下孵育 24 小时。
8. 用镊子将脑组织转移至装有 25 mL 30% 蔗糖溶液的 50 mL 锥形管中。在 4 °C 下保存 48–72 小时，直至脑组织沉降至管底。
9. 使用成年小鼠脑切片模具，在中脑水平（约冠状面位于前囟后 3 mm 处）切割脑组织。保留包含脑干的脑片。
   注意：此操作将产生两个脑片——一个包含大部分皮层（切面之前部分），另一个包含脑干/小脑（切面之后部分）。后续步骤使用脑干部分。
10. 将脑干部分切面朝下置于包埋模具底部，并用最佳切割温度化合物（OCT）包围；将包埋好的脑组织转移至 -80 °C 超低温冰箱中冷冻至少 12 小时，直至后续使用。
11. 在冷冻切片机上进行切片：将含有脑组织的 OCT 包埋模具放入冷冻切片机中；在切片机内孵育数小时，使脑组织块温度与切片机内部温度平衡。
12. 剥离包埋模具，暴露出含有脑组织的 OCT 包埋块。
13. 使用刀片去除包埋块表面多余的 OCT，注意不要触碰脑组织。
14. 将 OCT 包埋块固定在冷冻切片机的持样器上，使脑组织的切面朝前暴露。
15. 调整脑组织切面，使其与冷冻切片机的刀片平行。
16. 从延髓开始向头端方向修片，以 100 µm 厚度连续切片。
17. 向头端方向修片，直至小脑与脑干被切为一个连续的切片。开始以 50 µm 厚度收集切片。
    注意：当从延髓向头端修片时，脑干和小脑最初被分为两个独立的部分；随着向头端推进，脑干和小脑将在第四脑室水平融合。一旦第四脑室外侧边界清晰成形，则小脑与脑干将作为一个连续切片被切出。
    1. 用镊子夹取被 OCT 包围的脑片，放入盛有 PBS 的 24 孔板孔中（图 1a）。蓝斑核（LC）在小脑与下丘交汇处（约前囟后 -5.52 mm）最为明显（图 2b）。
       注意：当小脑完全被切过，不再包围下丘（约前囟后 -5.34 mm）时，蓝斑核最前部将消失（图 2c）。

2. 多巴胺β-羟化酶（DBH）或酪氨酸羟化酶（TH）的免疫组织化学染色（图1）

1. 第1天
   1. 用PBS清洗选定的脑片，每次5分钟，共清洗三次。
   2. 在4 °C条件下，使用含0.5%去污剂的磷酸盐缓冲液（PBSD）透化处理24小时。
      1. 将125 µL去污剂溶于25 mL PBS中。
2. 第2天
   1. 用0.5% PBSD清洗脑片，每次5分钟，共清洗三次。
   2. 加入一抗（抗DBH或抗TH抗体），在0.5% PBSD中按1:500稀释，4 °C孵育18小时。
3. 第3天
   1. 用0.5% PBSD清洗脑片，每次10分钟，共清洗三次。
   2. 加入合适的二抗（如用于绿色荧光的488标记驴抗兔抗体），在0.5% PBSD中按1:1000稀释，孵育16小时。
   3. 用铝箔包裹24孔板，并置于4 °C环境中。
   4. 用0.5% PBSD清洗脑片，每次5分钟，共清洗三次。
   5. 用PBS清洗5分钟。
   6. 使用绘图笔刷将脑片转移至盛有水的容器中。
   7. 将漂浮在水中的脑片贴附于带电荷的载玻片上。
   8. 用硬封片剂封片，检测多巴胺β-羟化酶（Dopamine beta-hydroxylase）表达。
   9. 将贴好的脑片在室温下干燥30分钟。
   10. 在共聚焦或荧光显微镜下成像，调整参数以检测相应二抗荧光染料的发射波长信号。
   11. 调节显微镜至脑片焦平面，以10倍物镜采集单张图像。

结果

图 1：通过脑切片 DBH 或 TH 免疫染色检测蓝斑核（LC）。 (a) 一只小鼠脑组织在脑干周围被切成 50 μm 厚的切片，并收集于两个 24 孔板中。每隔第 5 至第 8 片收集的脑切片被贴附在覆盖有薄膜的盖玻片上，用于 X 射线荧光显微成像（XFM）。这些切片在孔之间以蓝色数字标记。相邻的漂浮在磷酸盐缓冲液（PBS）中的切片则进行 DBH 免疫染色以检测蓝斑核（在孔上以红色叉号标记）。绿色圆圈表示 DBH 信号阳性的切片，因此含有蓝斑核。 (b) 一张包含蓝斑核的冠状脑切片经 DBH 免疫染色后，在共聚焦显微镜下成像。图像显示蓝斑核区域有强烈的绿色信号。 (c) 一张包含蓝斑核的冠状切片经酪氨酸羟化酶（TH）免疫染色后，在荧光...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
成年小鼠脑切片矩阵	Zivic Instruments	BSMAS001-1
驴抗兔二抗，Alexa Fluor 488 标记	Thermo Fisher Scientific	A-21206
带电玻璃载片	Genesee	29-107
共聚焦显微镜	Zeiss	LSM 800
冷冻切片机	Microm GmbH	HM 505E
冷冻切片机刀片	Thermo Fisher Scientific	MX35
微型剪刀，9.5 cm	Antech Diagnostcs	503241
DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）	Sigma-Aldrich	D9542-10MG
多巴胺β-羟化酶（DBH）抗体——实验室自制（来源：兔）	B. Eipper	-
多巴胺β-羟化酶（DBH）抗体——商业可得（来源：兔）	Cell Signaling	8586
Falcon 管，50 ml	USA Scientific	339652
异氟烷（Forane）	Baxter	NDC 1019-360-60
显微有齿镊（Micro Adson 镊）	Antech Diagnostcs	501245
硬性封片介质	EM sciences	17984-24
显微镜	Pascal	LSM 5
多孔板，24 孔	Thermo Fisher Scientific	930186
最佳切割温度包埋剂（OCT）	VWR/ tissue tech	102094-106
多聚甲醛（PFA）/ 10% 甲醛	Fisher Scientific	SF98-4
一次性 Peel-A-Way 包埋模具	Polysciences Inc.	18646A
画笔
磷酸盐缓冲液（PBS）	Life Tech	14190250
剃须刀片	Amazon	ASIN: B000CMFJZ2
刮勺	Antech Diagnostcs	14374
T 形针	Office Depot	344615
《立体定位坐标系中的小鼠脑》，Paxinos 与 Franklin，第 3 版	Amazon	ISBN: 978-0123694607
Triton-X 100（用于配制 PBSD）	Sigma-Aldrich	T8787
Tween 20	Sigma-Aldrich	P7949-500ml
酪氨酸羟化酶（TH）抗体（来源：兔）	EMD Millipore	AB152
宽场荧光显微镜	Zeiss	Axio Zoom.V16