来源：Vogt, D. 等., 病毒介导的内侧神经节隆起（MGE）细胞标记与移植 体内 研究。 视频实验杂志 (2015).
本视频展示了内侧神经节隆起（MGE）细胞的病毒标记及其移植，用于体内研究。该方法概述了使用病毒报告基因转导MGE细胞、将转导后的细胞移植到幼鼠大脑皮层，以及在特定中间神经元亚型中实现报告基因表达的各个步骤。
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病毒介导的内侧神经节隆起细胞标记及其体内研究中的移植
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2025年7月8日
本文内容
摘要
方案
所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。
1. 慢病毒制备（可选步骤）
- 将每种待制备的慢病毒分别接种于三块10 cm培养板的HEK293T细胞中，每板加入10 ml DMEM/10% FBS，培养至细胞融合度达约60–70%。将细胞置于37℃培养箱中培养。 °C，5% CO₂2.
- 转染以下DNA质粒（10 µg 总量）加入每孔板，使用任何转染试剂：6.4 µg CAG-Flex-GFP 慢病毒载体，1.2 µpMD2.G（编码VSV-g），1.2 μg µg pRSV-Rev 和 1.2 µg pMDLg/pRRE。这三种慢病毒包装载体可商业购得。
注意： 该方法采用第三代慢病毒载体，但第二代载体及相关质粒同样适用。 - 在生物安全二级（BSL2）认证的生物安全柜内准备一个含有10%次氯酸钠溶液的废液容器，用于灭活接触过或含有慢病毒的溶液或器械。转染后4-6小时，将培养基完全移除并加入至次氯酸钠溶液中，随后更换等体积的新鲜培养基，继续培养细胞。
- 4 天后，将培养基收集至 50 ml 锥形管中，在 1,000 × g 离心 15 分钟，以沉淀所有细胞碎片。随后，将上清液通过 0.45 μm 滤膜过滤 µ膜。任何低蛋白结合的滤膜（如PVDF）均适用。 注意： 将固体和液体病毒废弃物放入次氯酸钠溶液中。
- 将30 ml过滤后的上清液加入超速离心管中，置于超速离心机内。在4℃条件下以100,000 × g离心2.5小时 °C. 在生物安全二级（BSL2）生物安全柜中打开离心管，将上清液移除至含10%次氯酸钠的容器中。加入约100 µ加入 PBS 至沉淀，得到滴度为 1×10¹⁰7 至 1×108 感染单位/毫升。次日分装并储存在 -80 ºC. 慢病毒分装样品在 -80℃ 下稳定 °至少六个月的 C。
- 重要注意事项： 许多机构现已设立病毒核心实验室。获取浓度不低于1×10⁸ TU/mL的浓缩病毒7 每毫升感染单位，以获得最佳结果。
2. 用于MGE解剖的供体小鼠
- 首先，将一种表达 Cre 的目标品系与野生型（WT）小鼠或一种在 Cre 介导的重组后可表达报告基因的小鼠进行定时交配。
注意： 许多 Cre 驱动品系为转基因品系，通常以半合子状态维持和繁殖。因此，仅有一半的胚胎会携带 Cre 转基因。可从胚胎中快速提取 DNA，并通过短片段 PCR 检测 Cre 等位基因。随后可收集 Cre+ 胚胎，以确保仅使用目标基因型的 MGE 组织。或者，也可利用 Cre 依赖的报告基因来筛选用于 MGE 分离与移植的胚胎。 - 计算出对应胚胎发育第 13.5 天（E13.5）的日期。若动物于前一晚配对，则发现阴栓的当天记为 0.5 天。订购经定时交配的怀孕小鼠，或准备带有出生后第 1 天（P1）幼崽的野生型雌鼠，以便在供体组织达到 E13.5 时，同时获得 P1 阶段的受体小鼠。或者，可在配对供体动物前一周内在本实验室自行安排上述交配。
注意： 同一天同时获得 E13.5 胚胎和 P1 幼崽的前述策略通常难以可靠实现。
3. 培养基、工具和设备的准备。
- 准备MGE细胞制备所需的试剂和工具（表1）。
- 准备一个洁净的操作台面，并将洁净的镊子、剪刀以及显微手术刀或精细镊子（用于精确组织解剖）放置于台面上。
- 准备用于解剖的Hank's平衡盐溶液（HBSS），以及含有10%胎牛血清（FBS）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM），用于转导。
- 在37 °C组织培养箱中预孵育20–30 ml DMEM/10% FBS，约1小时。培养瓶盖应略微松开，以允许气体交换并使培养基pH达到平衡。
注意： 培养基的预孵育可在开始解剖前立即进行。
4. MGE 细胞制备
- 根据批准的动物实验方案处死怀孕小鼠，并将胚胎取出置于含有冰冻HBSS的10 cm培养皿中。
- 在解剖显微镜下逐个取出每个胚胎的脑组织（一次处理一个，其余胚胎保持在冰冻HBSS中），随后进行MGE组织的分离。
注意：以下步骤及图1详细展示了如何去除MGE组织。- 将脑组织腹面朝上放置（图1A, A'）。注意：背侧朝上亦可接受。沿矢状面将脑组织切成两半，得到两个半脑。示例半切脑组织如（图1B, B'）所示；注意脑组织的背侧（上方皮层）和腹侧部分包裹并围绕着神经节隆起（GE）组织。
- 接着，用主手持极细镊子或刺刀（表1），同时用非主手的镊子固定半脑组织（半脑的内侧应朝上）。用镊子和刺刀展开背侧与腹侧组织，以暴露下方的GE组织（见图1C及示意图图1C'）。
注意：从解剖用培养皿中移除部分液体有助于在MGE解剖过程中更稳定地固定组织。 - 使用刺刀或细镊子进行直线切割，分离CGE、LGE和隔区组织（参见红色虚线所示示例切割位置，图1D 和 D'）。这些切口的顺序可任意进行。
注意：可将MGE想象成一个被从周围组织中“切出的盒子”。这种方法有助于在每次解剖时重复进行相似的切割，从而减少组织解剖的变异性。 - 最后，将MGE侧置，并修剪掉底部（即脑组织的外侧部分），从而去除MGE的套层区（见图1E 和 1E'中丢弃部分），保留MGE其余部分。剩余的MGE组织主要包含脑室区和脑室下区部分，其中几乎含有全部的MGE前体细胞。继续使用该组织进行后续操作。
- 重要提示：在培养皿底部添加硅胶凝胶可提供极佳的解剖操作表面，既能保护镊子精细尖端，又能为用镊子固定组织提供柔软的支撑面。
5. 慢病毒标记与移植
- 将MGE组织的试管转移至BSL2级生物安全柜中，并移除培养基。
注意： MGE组织足够大，肉眼可见，且会沉降至试管底部，因此可轻松而轻柔地移除冷培养基。 - 加入约500 µl已在37 °C细胞培养孵育箱中预温的DMEM/10% FBS培养基。随后，向每根试管中加入polybrene，使终浓度为8 µg/ml，以促进转导。使用P1000移液器枪头反复吹打MGE组织，制成单细胞悬液。最后，向每根试管中加入约15–20 µl浓缩的慢病毒液。
- 重要注意事项： 对单个胚胎来源的MGE组织，吹打10–12次通常足以将其充分解离；但如果合并多个MGE组织，则可能需要更多次吹打。建议尝试不同的吹打条件，以确定最佳操作参数。
- 将每根试管盖紧，轻轻颠倒混匀，然后将所有试管放入37 °C孵育箱中。在慢病毒液中孵育细胞至少30分钟，最长不超过1小时；更长时间会导致细胞活力下降。每隔10分钟轻轻颠倒试管一次，直至孵育结束。
- 慢病毒感染孵育结束后，从孵育箱中取出试管，在约700 × g条件下离心3分钟，使细胞沉淀。在BSL2生物安全柜中吸除上清液，并将其弃入10%漂白剂溶液中。随后，向每管加入1 ml DMEM/10% FBS培养基，吹打2–3次以洗涤细胞沉淀，再以相同速度离心收集细胞。重复此洗涤步骤2–3次，以彻底去除残留病毒。
注意： 建议所有离心步骤在4 °C下进行；但在室温下进行短暂离心并未观察到细胞活力明显下降。 - 最后一次洗涤后，尽可能吸除培养基，并将每根试管置于冰上。由于管壁残留少量培养基，待移植操作开始时，约有2–3 µl液体将覆盖在细胞沉淀表面。
6. 移植与验证
- 获取宿主 P1 代幼鼠，并用 70% 乙醇喷洒操作区域以进行准备。为在操作过程中维持无菌环境，建议在专用的洁净操作室内进行本操作。此外，使用经过高压灭菌的手术器械，并用 70% 乙醇对幼鼠将接触的表面进行消毒。用于进行移植操作的代表性设备及代表性操作区域如图 2所示。
注意：尽管本操作属于小体积注射，不涉及需要切口、开放性伤口或缝合的外科手术，但仍建议每只待注射小鼠使用新的微量移液管。微量移液管在拉制和斜面处理时应在已喷洒 70% 乙醇的表面上进行，并在密封容器中保存，以实现热力灭菌。- 制备微量移液管，使其尖端直径在 40–80 µm 之间。遵循此尺寸范围可获得最佳效果。在拉制和斜面处理微量移液管时进行热力灭菌，并在将其存入密封容器前，用 70% 乙醇喷洒处理过的表面进行操作。
注意：若无法获得制备此类针头所需的设备（表 1），可选用其他注射装置作为替代。然而，由于直径不同，这些装置可能不如微量移液管适用。 - 用 1 ml 注射器吸取矿物油，并使用 30 1/2 G 针头将玻璃移液管完全充满矿物油。随后，将推杆安装至立体定位仪上，再将玻璃移液管连接至立体定位仪并装载到推杆上。使用液压驱动装置，将推杆推入玻璃移液管约一半深度，并用干净的纸巾擦去溢出的矿物油。
- 替代使用注射器的方法：将移液管后端浸入矿物油中，通过毛细作用充满。为防止移液管内产生气泡，在完全退出玻璃移液管前应始终保持注射器上的正压。
注意：其他设备也可成功用于 MGE 细胞移植。任何能够输送小于或接近 100 nl 体积的装置均适用于本操作。
- 替代使用注射器的方法：将移液管后端浸入矿物油中，通过毛细作用充满。为防止移液管内产生气泡，在完全退出玻璃移液管前应始终保持注射器上的正压。
- 接下来，使用无菌纸巾或其他吸水材料，将其一角拧成细尖，轻柔地吸除 MGE 细胞沉淀上方多余的培养基。此步骤可提高细胞密度，从而实现更小的注射体积。随后，使用低容量移液器（推荐使用 P2 型）缓慢吸取细胞沉淀，并吹打 1–2 次，再将细胞悬液转移至疏水表面。总体积应略低于 1 µl。将针头尖端插入细胞悬液中，并使用液压驱动装置将细胞悬液吸入移液管内。
- 通过低温麻醉法对 P1 代幼鼠进行麻醉（用乳胶手套包裹后置于冰上约 2–4 分钟）。通过有害刺激检查麻醉效果：用精细镊子轻捏脚趾间皮肤，幼鼠应无反应。随后，将幼鼠放置于注射装置下方的模具上，向后拉紧头部皮肤并用普通实验室胶带固定，使皮肤绷紧。
注意：尽管低温麻醉对新生小鼠非常有效且死亡率较低，但操作必须迅速，因为幼鼠在不到 10 分钟内即开始恢复。此外，冰上放置 4 分钟为可耐受的上限时间。若需更长注射时间，应尽量仅诱导一次低温麻醉。然而，若幼鼠过早恢复，应先让其完全恢复后再进行第二次低温麻醉。此外，最多仅可再诱导一次低温麻醉以完成注射。幼鼠通常在低温麻醉后 5–10 分钟内恢复，可通过将其放回同窝幼鼠和母鼠身边，或置于温暖表面以促进恢复。 - 使用立体定位仪，将玻璃移液管尖端垂直置于幼鼠头部表面。当移液管接触头部表面时，将此位置记为“0”。随后，将移液管穿过皮肤和颅骨进入皮层，并前后插入和回撤约 2 次后停止。为最佳靶向新皮层，建议在微量移液管插入深度为 0.1 mm 时进行注射。然而，用户应根据实际情况优化该深度（见下文注释）。
注意：尽管上述设备在该深度下可稳定靶向新皮层深层，但仍应通过实验测试多个深度以确定最佳值。此外，应在不同的前后（rostro-caudal）和内外（medio-lateral）位置测试一系列深度，以确定各注射位点的最佳深度。同时，初始穿刺应迅速进行，缓慢穿透新皮层会降低组织穿透的清晰度。初次操作时可尝试不同速度以找到最佳效果。此外，在测试坐标时，使用标记细胞是无可替代的方法，因为染料在标记位置方面并不可靠。 - 当针头到位后，旋转液压装置，推动推杆进入玻璃移液管，将设定体积的细胞悬液注入皮层。每个位点注射 50–70 nl。若目标是在整个新皮层实现广泛的细胞分布，则在 3–6 个不同前后水平的位点重复此操作。
注意：注射体积达 100 nl 或更大时可能造成损伤，并导致大量细胞聚集在注射部位，无法有效迁移出去。因此，若时间允许，建议在更多位点使用较小注射体积（约 70 nl 或更少），以达到最佳效果。 - 注射完成后，将幼鼠从操作台上移开并做标记（剪趾是一种可靠的后期识别方法）。待幼鼠恢复自主活动能力后（通常在移下操作台后几分钟内发生），将其放回母鼠和同窝幼鼠中。
注意：由于本操作为微创性操作，一旦幼鼠能够自由活动并恢复体温，无需进行术后护理。但不仅应在操作后检查幼鼠，次日也应继续观察，确保其无健康恶化的迹象。 - 在开始下一只幼鼠的操作前，用 70% 乙醇喷洒操作区域，以维持无菌工作环境。让已注射的幼鼠继续发育，并在适当的发育阶段评估组织。
- 制备微量移液管，使其尖端直径在 40–80 µm 之间。遵循此尺寸范围可获得最佳效果。在拉制和斜面处理微量移液管时进行热力灭菌，并在将其存入密封容器前，用 70% 乙醇喷洒处理过的表面进行操作。
表1. 试剂与工具清单。 商业化试剂的清单，包括培养基、解剖工具、用于移植的代表性设备以及DNA载体。（n.a.）不适用或不可获得。
| MGE细胞制备与转导所需的试剂和设备 | Catalog # | Company | ||
| 1) | 高糖Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM） | 12491-015 | Life Technologies | |
| 2) | 热灭活胎牛血清（FBS） | 10437-077 | Life Technologies | |
| 3) | 无钙镁Hanks平衡盐溶液（HBSS） | 14170-112 | Life Technologies | |
| 4) | 1.5 ml 微量离心管（或其他带盖收集管） | 3810X | Eppendorf International | |
| 5) | Polybrene | sc-134220 | SantaCruz Biotechnology | |
| 6) | 直型22.5°手术刀片（可选） | REF 72-2201 | Surgical specialities corporation | |
| 7) | 用于组织解剖的培养皿（10 cm） | FB0875713 | Fisher Scientific | |
| 8) | 精细尖头镊子2把（如Dumont #5） | 11254-20 | Fine Scientific Tools | |
| 9) | 配备5% CO2输入的37 °C细胞培养箱 | C150 | Binder | |
| 10) | 可离心1.5 ml微量离心管的台式离心机 | |||
| 11) | 可用于细胞吹打的P1000移液器 | |||
| 12) | 生物安全二级操作台 | |||
| 体外MGE原代培养所需的试剂和设备 | Catalog # | Company | ||
| 1) | Lab-Tek II带盖腔室载玻片，8孔 | 154941 | Thermo Fisher | |
| 2) | 聚-L-赖氨酸（0.1% 质量/体积） | P8920 | Sigma Aldrich | |
| 3) | 小鼠层粘连蛋白（0.5–2 mg/ml） | 23017-015 | Life Technologies | |
| 4) | Neurobasal培养基 | 21103-049 | Life Technologies | |
| 5) | B27无血清添加剂 | 17504044 | Life Technologies | |
| 6) | Glutamax（100倍储存液） | 35050-061 | Life Technologies | |
| 7) | 青霉素-链霉素（100倍储存液） | 15070-063 | Life Technologies | |
| 8) | 葡萄糖（配制成25%水溶液） | G5400 | Sigma Aldrich | |
| MGE细胞移植所需的试剂和设备 | Catalog # | Company | ||
| 1) | 1 ml 注射器 | REF 309602 | BD, Becton Dickinson and company | |
| 2) | 30½ G 针头 | 305106 | BD, Becton Dickinson and company | |
| 3) | 精密微量注射器，用于递送5 µl液体（附带推杆） | 5-000-1005 | Drummond scientific company | |
| 4) | Parafilm封口膜 | PM-999 | Polysciences, Inc. | |
| 5) ** | 带臂架的体视显微镜 | MZ6 | Leica | |
| 6) ** | 小鼠专用数字立体定位仪 | 51725D | Stoelting company | |
| 7) ** | 单轴油压精细显微操作器 | MO-10 | Narishige | |
| 8) | 金刚石涂层旋转磨刀器 | n.a. | 自制 | |
| 9) | 玻璃微电极拉制仪 | 730 | Kopf instruments | |
| 10) | 矿物油 | n.a. | 任意药店或药房 | |
| 11) | 可精确量取1 µl体积的移液器及吸头 | |||
| ** 此处列出的是我们使用的型号，但其他多种设备配置亦可适用 | ||||
| 可选试剂（用于制备慢病毒） | Catalog # | Company | ||
| 1) | 25 mm，0.45 µm 滤膜 | 09-719B | Fisher Scientific | |
| 2) | 超透明离心管（25 × 89 mm） | 344058 | Beckman Coulter® | |
| 3) | Lipofectamine 2000 | （1.5 ml 规格） | 11668019 | Invitrogen |
| 其他市售材料 | Catalog # | Company | ||
| 1) | 编码gag/pol的pMDLg/pRRE质粒 | 12251 | Addgene | |
| 2) | 编码Rev的pRSV-Rev质粒 | 12253 | Addgene | |
| 3) | 编码VSVG的pMD2.G质粒 | 12259 | Addgene | |
| 4) | pAAV-Flex-GFP | 28304 | Addgene | |
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结果
图1. E13.5期MGE组织解剖的代表性操作流程。 用于原代培养或移植实验的MGE组织解剖示例。（A-E） E13.5期脑组织解剖图像，（A'-E'） 相应示意图，用于突出显示关键结构及操作中的重要步骤。（A, A'） 从腹侧观察的E13.5期脑组织代表性图像。红线表示第一道切割线，用于将脑组织沿中线切为两半。（B, B'） 单侧脑半球的视图。内侧结构可见，外侧朝下。覆盖在神经节隆起上方的是背侧皮层组织（蓝色），此外，需去除的腹侧组织以橙色标示。（C, C'） 去除覆...
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| MGE细胞移植所需的试剂与设备 | |||
| 1 ml 注射器 | REF 309602 | BD, Becton Dickinson and company | |
| 301/2 规格针头 | 305106 | BD, Becton Dickinson and company | |
| 精密内径移液管，用于递送 5 µl（附带推杆） | 5-000-1005 | Drummond scientific company | |
| Parafilm 封口膜 | PM-999 | Polysciences, Inc. | |
| 带臂式支架的体视显微镜 ** | MZ6 | Leica | |
| 数字式小鼠立体定位仪 ** | 51725D | Stoelting company | |
| 单轴油压精细显微操作器 ** | MO-10 | Narishige | |
| 金刚石涂层旋转斜面研磨器 | n.a. | 自制 | |
| 针状移液器拉制仪 | 730 | Kopf instruments | |
| 矿物油 | n.a. | 任意药店或药房 | |
| 任何可准确量取 1 µl 体积的移液器及吸头 | |||
| ** 上述为本研究中使用的特定型号，但其他类似设备亦应适用 | |||
| 可选试剂（用于制备慢病毒） | |||
| 25 mm，0.45 µm 滤膜 | 09-719B | Fisher Scientific | |
| 超透明离心管（25 x 89 mm） | 344058 | Beckman Coulter® | |
| Lipofectamine 2000（1.5 ml 规格） | 11668019 | Invitrogen | |
| 其他市售耗材 | |||
| 编码 gag/pol 的 pMDLg/pRRE 质粒 | 12251 | Addgene | |
| 编码 Rev 的 pRSV-Rev 质粒 | 12253 | Addgene | |
| 编码 VSVG 的 pMD2.G 质粒 | 12259 | Addgene | |
| pAAV-Flex-GFP | 28304 | Addgene |
