从小鼠脑组织间液中进行微透析以分离细胞外蛋白质

摘要

来源：Yamada, K. 体内 使用高分子量截留探针从脑组织间液中收集大分子细胞外蛋白的微透析方法 视频实验杂志 (2018)

该视频展示了使用微透析探针从小鼠脑组织的间质液（ISF）中收集细胞外蛋白质的过程。将带有高分子量截留阈值的半透膜的微透析探针，通过预先植入的导向套管插入麻醉小鼠的脑内。探针连接至泵系统，使生理缓冲液灌注脑组织并与间质液混合。间质液中的蛋白质通过半透膜扩散，进而被收集用于分析。

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 术前准备

1. 手术开始前，用70%乙醇擦拭所有物品以维持无菌条件。建议使用加热垫提供热支持。
2. 通过腹腔注射水合氯醛（400 mg/kg）对小鼠进行麻醉。通过夹趾反应确认麻醉效果。建议在麻醉诱导时使用缓释美洛昔康（meloxicam SR），并在恢复期间每日两次（bis in die，BID）给予布托啡诺（buprenorphine），持续至少24小时。
3. 使用手术剪剃除头部毛发。利用耳杆和鼻夹将小鼠固定在小鼠与新生大鼠适配器上。
   注意：此步骤中必须确保小鼠头部牢固固定，避免左右移动。
4. 在麻醉期间，于眼睛表面涂抹兽用眼膏以防止干燥。

2. 用于导管套管植入的立体定位手术

1. 将小鼠和新生大鼠适配器安装到立体定位仪上。使用手术刀在颅骨上方的皮肤上做矢状切口。用湿润的棉签擦去颅骨上的血液和结缔组织。
2. 使用脑图谱确定目标脑区的坐标。在开始测量前，确保中线笔直，以便钻头在前后方向移动时始终位于中线缝线上。
   注意：本文使用坐标（前后方向 [A/P]：-3.1 mm，内外侧方向 [M/L]：-2.5 mm，背腹方向 [D/V]：-1.2 mm，12度）定位后部海马区。
3. 调平颅骨前后方向
   1. 将钻头安装在立体定位架的操纵臂上。降低钻头直至轻轻接触λ点，记录其腹侧坐标。对bregma点重复此操作。
      注意：当颅骨调平后，bregma点的垂直测量值应与λ点相等。若不相等，需相应调整鼻夹高度。颅骨调平后，记录bregma点的前后方向和内外侧方向坐标。
4. 调平颅骨左右方向
   1. 将钻头从bregma点移至坐标（前后方向 [A/P]：-3.1 mm，内外侧方向 [M/L]：+2.0 mm），降低钻头至颅骨表面并记录垂直坐标。然后对坐标（A/P：-3.1 mm，M/L：-2.0 mm）重复此操作。
      注意：若颅骨已调平，则这两个距中线等距点的垂直测量值应相等。若不相等，需调整耳棒高度。
5. 在目标坐标（A/P：-3.1 mm，M/L：-2.5 mm）小心钻出骨孔，用于植入引导套管。若骨孔直径不足以植入引导套管，可再钻一个与原孔重叠的新孔。在右侧（对侧）顶骨上再钻一个孔，植入骨螺钉，以帮助在步骤1.10中固定牙科水泥（见图1B）。
6. 用刀片从1.5 mL离心管盖子背面切下一个圆形锁紧片，制成一个“冠状环”。该环用于防止牙科水泥扩散至皮肤。将其放置在颅骨上，使步骤2.5中钻出的骨孔位于环内（见图1）。
7. 将引导套管安装在立体定位适配器的短臂上，并用螺帽固定，组成立体定位组件。将立体定位适配器的长臂安装在电极夹上，并将其固定在立体定位仪的操纵臂上（见图1A）。
8. 将立体定位组件在操纵臂上旋转12度（背腹方向，D-V）（见图1B）。将引导套管移至步骤1.6中钻出的骨孔上方，缓慢将其插入脑组织，下降1.2 mm。
   注意：探针角度针对海马区特异性设计；其他脑区可能需要不同角度或无需倾斜。请参考脑图谱获取精确坐标。务必干燥颅骨表面，否则水泥无法牢固粘附，水泥帽可能脱落。
9. 在冠状环内添加牙科水泥，完全覆盖引导套管的金属部分和骨螺钉，确保其稳固。若颅骨有暴露区域，需额外添加牙科水泥。
10. 等待牙科水泥完全干燥（约12–20分钟）。从电极夹上取下立体定位适配器。取下螺帽，将立体定位适配器更换为假探针，并重新拧紧螺帽。
11. 将小鼠从立体定位仪上释放，单独饲养于独立笼具中。
    注意：在小鼠恢复足够意识、能够维持胸卧位之前，不得无人看管。每日检查小鼠状态，直至进行微透析实验当天。若小鼠表现出疼痛迹象，应给予非甾体类抗炎药（NSAIDs），如卡洛芬。睡眠-觉醒研究需等待2周，以便小鼠适应新环境；但其他类型研究可能只需较短恢复期（例如，1–2天）。

3. 微透析装置设置

1. 探针质量检查：用蒸馏水填充一次性1 ml注射器，并使用拜通管（byton tube）将其连接到探针的出口（较短的端口）。用手指堵住通气孔，轻轻推动注射器活塞，将水注入探针。检查水是否从探针入口流出，且微透析膜表面无泄漏。
   1. 探针活化：将探针的膜部分浸入乙醇（70–100%）中约两秒钟。然后再次使用注射器向探针内注入蒸馏水。
2. 灌注缓冲液的配制：为避免目标分子在管路中吸附，使用人工脑脊液（aCSF：1.3 mM CaCl₂、1.2 mM MgSO₄、3 mM KCl、0.4 mM KH₂PO₄、25 mM NaHCO₃、122 mM NaCl，pH = 7.35）将30% BSA溶液稀释至4%，配制成含4%牛血清白蛋白（BSA）的灌注缓冲液。aCSF的电解质浓度与脑脊液相近。使用前立即配制，并通过孔径为0.1 µm的注射器滤器过滤。
   注意： 4%牛血清白蛋白（BSA）可提高易吸附蛋白的回收率，但会显著限制化合物的递送，尤其是高BSA结合率的化合物。在某些情况下，使用较低浓度的BSA（如0.15%）是一个优势。请注意，BSA在涡旋振荡器或搅拌板上剧烈搅动时极易发生聚集，这些聚集物可能堵塞探针或膜孔。配制BSA溶液时应谨慎操作，以减少聚集现象。
3. 分别准备进样和出样管路（见图1C），并用连接针将两条管路连接。取一次性3 mL注射器，装满灌注缓冲液，使用钝头针将其连接至管路的进样端。启动注射泵，用灌注缓冲液充满整个管路。
4. 停止注射泵运行，将进样管与出样管之间的连接针替换为步骤3.3中已活化的微透析探针（见图1C）。在更换前，先将探针的螺帽套在探针上。
5. 将出样管路上的滚轴管安装至滚轴泵上。先以10 µL/min的流速启动注射泵，随后以略低的流速（9.5–9.8 µL/min）启动滚轴泵。务必排除整个管路中的所有气泡，因为气泡进入探针后可能影响回收率。
6. 按照步骤1.2的方法对步骤1.12中的小鼠进行麻醉，在其颈部佩戴固定环。取下探针螺帽和假探针，缓慢将步骤3.4中的微透析探针经引导套管插入，然后拧紧螺帽固定。
7. 将小鼠放入连接自由活动系统的笼子中，并通过固定环将其与系统连接。持续以步骤3.5中指定的流速运行注射泵和滚轴泵至少1小时。
   注意： 为实现清醒动物脑间质液（ISF）的采集，本文采用自由活动系统，该系统中笼子本身可随动物移动而移动，防止管路扭曲。此外，也可使用各厂商提供的液体旋转接头（liquid swivels）。
8. 首先停止滚轴泵，然后停止注射泵。设定所需的流速，使注射泵的运行速度比滚轴泵快20%。
   注意： 例如，若目标流速为1 µL/min，则注射泵应以1.2 µL/min运行。最佳流速需根据每种分子的特性通过实验经验确定。
9. 收集ISF样品：将出样管路的自由端置于冷藏式组分收集器上。
   注意： 合适的样品体积取决于后续分析所采用的检测方法。
10. 实验结束后取出探针（必要时对小鼠进行麻醉）。小鼠恢复处理方式与步骤2.11相同。使用高效液相色谱法（HPLC）或酶联免疫吸附测定法（ELISA）等方法分析所收集的ISF样品。
11. 微透析结束后清洗整个管路：将探针替换为连接针，重新连接进样与出样管路，然后在整个管路中通入稀释的漂白剂，随后用水冲洗。干燥后保存，以供重复使用。
    注意： 其他类型的管路也可使用，但灌注缓冲液中的BSA可能堵塞小直径管路，因此此类管路建议一次性使用。管路在多次使用后可能出现磨损或堵塞，因此每次使用前必须确保流速稳定一致。

结果

图1：手术装置及微透析回路的构建。(A) 使用盖形螺母、立体定位适配器和引导套管组装用于引导套管植入的立体定位装置。(B) 进行立体定位手术以植入引导套管。引导套管以相对于垂直方向12度的角度插入脑内。(C) 构建进样管路和出样管路。进样管路由70 cm FEP管（JF-70）组成，出样管路由JF-70、滚轴管和一半长度的FEP管组成。各连接处使用连接针进行连接。(D) 当整个管路充满灌流缓冲液后，停止泵运行，并将进样管路与出样管路之间的连接针替换为已活化的微透析探针。务必确保将进样管路末端连接至探针的进样口（较长端口），并将出样管路末端连接至探针...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Univentor 820 微量采样器	Univentor	8303002	冷藏式组分收集器
注射泵	KD scientific	KDS-101
蠕动泵	Eicom 微透析	ERP-10
Raturn 独立系统	BASi	MD-1409	自由活动系统
双物种笼具套件	BASi	CX-1600
AtmosLM 微透析探针（轴长 8 mm，膜长 2 mm）	Eicom 微透析	PEP-8-02	探针、导管、假探针及立体定位适配器的轴长应相同。
微透析导管（轴长 8 mm）	Eicom 微透析	PEG-8
微透析假探针（轴长 8 mm）	Eicom 微透析	PED-8
颅骨螺钉	BASi	MD-1310
Super bond C&B 套装	Sunmedical		牙科水泥
带数字显示控制台的小动物立体定位仪	Kopf	Model 940	立体定位装置
小鼠和新生大鼠适配器	Stoelting	51625
标准耳杆及小鼠立体定位用橡胶尖端	Stoelting	51648
牛血清白蛋白溶液	Sigma	A7284-50ML	30% BSA 溶液
FEP 管（70 cm）	Eicom 微透析	JF-10-70	内体积 = 0.5 µL/cm
特氟龙管（50 cm）	Eicom 微透析	JT-10-50	内体积 = 0.08 µL/cm
Byton 管	Eicom 微透析	JB-30
Intramedic luer stab 适配器 23G	BD	427565	钝端针头
滚轮管	Eicom 微透析	RT-5S	内体积 = 4 µL
螺帽	Eicom 微透析	AC-5
0.25 mL 带盖微量离心管	QSP	503-Q	组分收集器用管
立体定位适配器（轴长 8 mm）	Eicom 微透析	PESG-8
连接针	Eicom 微透析	RTJ
小鼠动物颈圈	BASi	MD-1365
高速旋转微型电机套件	FOREDOM	K.1070	钻机
荷包牡丹碱	Sigma	P1675
用于颅骨螺钉的螺丝刀
手术刀
棉签
外科剪毛器