基于基质的微胶质细胞-胶质母细胞瘤共培养肿瘤侵袭模型

摘要

来源：Coniglio, S.，等. 巨噬细胞和小胶质细胞促进胶质母细胞瘤侵袭的共培养实验。J. Vis. Exp. (2016)

在本视频中，将胶质母细胞瘤细胞和小胶质细胞与聚合物基质溶液混合后转移至多孔培养插件中，在其中形成凝胶以包埋细胞。小胶质细胞可促进胶质母细胞瘤细胞穿过该多孔插件，模拟肿瘤细胞向周围组织的侵袭过程。随后对细胞进行固定并制备，以用于后续分析。

方案

1. 细胞的荧光标记

注意：用荧光染料标记胶质母细胞瘤细胞系和小胶质细胞9。或者，构建稳定表达GFP/RFP等荧光蛋白的细胞系。

1. 将细胞接种于6孔板中，使其在染色当天达到70%–80%融合度。对于小鼠胶质母细胞瘤细胞系GL261和人胶质母细胞瘤细胞系U87，分别在染色前24小时于6 cm培养皿中接种1 × 10⁶和1.5 × 10⁶个细胞。
2. 在二甲基亚砜（DMSO）中配制荧光细胞染料溶液，并将5 µM染料加入培养基中（RPMI或无血清巨噬细胞培养基MSFM），充分涡旋混匀。
3. 在37 °C、5% CO₂条件下，将细胞与染料共同孵育30分钟。
4. 移除含染料的培养基，向细胞中加入新鲜培养基（RPMI或MSFM）。
5. 继续孵育细胞30分钟。注意：细胞现已完成染色，可直接用于后续实验。

2. 三维基质包埋胶质瘤与巨噬细胞/小胶质细胞的侵袭实验

1. 在4 °C下过夜解冻基质混合物。后续所有操作均需在冰上、于生物安全柜中进行。
2. 在冰上用含0.3% BSA的培养基（MSFM或RPMI）配制浓度为10 mg/ml的基质溶液。
   注意：基质的储存浓度通常约为15 mg/ml。
3. 为将细胞（步骤1中标记的细胞）悬浮于基质中，先通过抽吸去除细胞培养基。用2 mM EDTA（乙二胺四乙酸）/PBS（磷酸盐缓冲液）洗涤培养皿中的细胞。向细胞中加入500 µl的2 mM EDTA/PBS，于37 °C、5% CO₂条件下孵育5–10分钟。
4. 将细胞重悬于5 ml含0.3% BSA的培养基中。
5. 以120 × g离心5分钟。
6. 吸除沉淀上的上清液。将沉淀重悬于含0.3% BSA的培养基中，使细胞浓度达到1 × 10⁶ 个细胞/ml。使用血细胞计数板对细胞进行计数。
7. 将1.5 × 10⁵个GL261细胞（体积150 µl）和5 × 10⁴个小胶质细胞（体积50 µl）加入一个1.5 ml微量离心管中。另取2 × 10⁵个GL261细胞（体积200 µl）加入另一个1.5 ml微量离心管中。
   注意：单独的GL261细胞（不含小胶质细胞）作为对照。
8. 在微量离心机中以120 × g离心5分钟。
9. 将细胞沉淀在冰上用200 µl冷基质重悬。
10. 取50 µl（含50,000个细胞）接种至8 µm孔径的Transwell小室上室中央。
11. 于37 °C孵育30分钟，使基质发生聚合。
12. 向上室加入200 µl无血清培养基，向下室加入700 µl含血清的细胞生长培养基。
13. 于37 °C、5% CO₂条件下孵育48小时。
14. 孵育结束后，轻轻抽吸去除小室上表面的细胞，并将小室置于含3.7%多聚甲醛的PBS中固定。室温下固定15分钟（或4 °C过夜）。轻轻抽吸去除固定液，更换为500 µl 1× PBS。随后进入第4节进行图像分析。

结果

图1：检测小胶质细胞/巨噬细胞诱导胶质母细胞瘤细胞侵袭的两种不同实验方案示意图。上图显示预包被基质的小室侵袭实验。下图显示三维基质侵袭实验。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Corning BioCoat Matrigel 侵袭小室：含 BD Matrigel 基质	Corning/Fisher Scientific	Cat: 354481
巨噬细胞无血清培养基 (MSFM) (500 ml)	Life Technologies	12065-074
CellTracker Red CMTPX 荧光染料	Life Technologies/Molecular Probes	C34552
CellTracker Green CMFDA 荧光染料	Life Technologies/Molecular Probes	C2925
GL261 细胞系	美国国家癌症研究所 (NCI)
THP-1 细胞系	美国模式培养物集存库 (ATCC)	ATCC TIB-202
RPMI 1640 培养基 (500 ml)	Life Technologies/Gibco	11875-093
甲醛溶液	Sigma Aldrich	F1635
Corning Transwell 聚碳酸酯膜细胞培养小室（8 µm 孔径），每包 48 个	Corning	CLS3422
Cultrex 3-D 培养基质：低生长因子基底膜提取物，PathClear	Trevigen	3445-005-01
胎牛血清 (FBS)	Life Technologies	Cat: 10500064
牛血清白蛋白，第五组分，热激处理	Fisherscientific	BP1600-100
0.5 M EDTA	ThermoFisher Scientific	15575-020