研究淋巴细胞跨微血管内皮细胞单层的迁移

摘要

来源：Schulte-Mecklenbeck, A., 等., 使用淋巴细胞外渗分析 体外 人脑血液-脑屏障模型 视频实验杂志 (2017)

本视频展示了一项关于淋巴细胞穿过血脑屏障（BBB）内皮模型的实验研究。在体外培养形成一层人脑微血管内皮细胞（HBMECs）单层，随后将含有淋巴细胞的外周血单个核细胞（PBMCs）加入该单层细胞中。通过孵育使淋巴细胞发生跨内皮迁移，迁移后的细胞通过流式细胞术进行定量分析。

方案

1. 细胞培养小室的制备

1. 细胞培养小室的包被
   重要提示：避免触碰细胞培养小室的膜。
   1. 向每个细胞培养小室（图1A）以及96孔平底板中的一个孔（光学对照孔）加入100 µL纤连蛋白溶液。在37 °C下孵育至少3小时。孵育后吸除纤连蛋白溶液。
   2. 向细胞培养小室及光学对照孔中各加入100 µL HBMEC悬液。向细胞培养小室的下室加入600 µL内皮细胞基础培养基（ECM-b）。在37 °C、5% CO₂条件下孵育3–4天，直至形成屏障完整性（图1B），并通过显微镜观察光学对照孔中的HBMEC来检查细胞生长情况。
      注意：不建议细胞培养超过四天。

2. 迁移实验

1. 外周血单个核细胞（PBMC）的制备
   1. 加入10 mL Roswell Park Memorial Institute（RPMI）培养基至15 mL离心管中，并加入200 µL B27添加剂。计数PBMC，以300 × g离心5分钟。将PBMC重悬，最终浓度为5 × 10⁶个细胞/mL⁶ 细胞/mL RPMI/B27
2. 迁移实验的建立
   1. 从含有融合HBMEC单层的细胞培养小室的下室开始，吸出培养基，随后吸出上室的培养基（图1A每个供体分别向细胞培养插件中以及24孔板的每孔中各加入100 µL PBMC悬液体外 对照组
   2. 向细胞培养小室的下层加入 600 µL RPMI/B27，向 PBMC 中加入 500 µL 体外 对照并在 37 °C / 5% CO₂ 条件下孵育 6 小时_2.
3. 收获迁移的外周血单个核细胞
   1. 用镊子取出细胞培养小室，用400 µL磷酸盐缓冲液（PBS）小心冲洗底部，避免接触膜。弃去细胞培养小室。
   2. 向细胞培养小室的下室中加入 20 µL 流式计数荧光微球（约 1,000 个微球/µL），同时加入至 体外 对照并充分混匀。将1 mL所得PBMC悬液转移至流式细胞术管中。

3. 流式细胞术

1. 样品制备
   1. 将外周血单个核细胞（PBMC）在室温下以 300 × g 离心 5 分钟。
   2. 每份样品中，在 100 µL 流式细胞术缓冲液（PBS/1% 牛血清白蛋白 [BSA]/2 mM 乙二胺四乙酸 [EDTA]）中加入荧光素偶联抗体，配制抗体溶液。以下结果中，每份样品使用了 1 µL CD4-FITC（分化簇 4-异硫氰酸荧光素）、1 µL CD3-PerCP/Cy5.5（多甲藻叶绿素蛋白/氰基 5.5）、1 µL CD56-PC7（藻红蛋白氰素 7）、1 µL CD8-A700（Alexa Fluor 700）和 1 µL CD16-A750（Alexa Fluor 750）。
   3. 用 100 µL 抗体溶液重悬 PBMC，并在 4 °C 下孵育 30 分钟。
   4. 加入 250 µL 流式细胞术缓冲液，以 300 × g 离心 5 分钟。

结果

图1：NK细胞亚群在非炎症与炎症性HBMEC单层中的差异迁移。A. Transwell 小室的图片（左）和实验装置示意图（右）。 B. HBMEC屏障功能的验证。左图：培养3天的HBMEC中紧密连接分子ZO-1的免疫组织化学染色，使用兔抗人zonula occludens-1（ZO-1，Abcam，1:200）和山羊抗兔免疫球蛋白G/氰基3（IgG-Cy3，1:300）。中图：HBMEC在培养第2天至第4天期间的跨内皮电阻（TEER）。右图：在有（“炎症状态”，红色）或无（“非...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
PBS	Gibco	14190-094	不含 CaCl2 或 MgCl2
纤连蛋白 1mg/mL	Sigma	F1141-5MG	来源于牛血浆
HBMEC	ScienCell	1000
HBMEC	Pelobiotech	PB-H-6023
ECM-b	ScienCell	1001-b
FBS	ScienCell	1001-b
青霉素/链霉素	ScienCell	1001-b
内皮细胞生长补充剂	ScienCell	1001-b
Transwell	Corning	3472	透明，直径 6.5 mm，孔径 3.0 µm
96 孔平底板	Corning	3596
B27	Gibco	17504-044	50 倍浓缩
48 孔板	Corning	3526
RPMI 1640	Gibco	61870-010
Flow Count Fluorospheres	Beckman Coulter	7547053
Na-EDTA	Sigma	E5134
BSA	Sigma	A2153
CD3-PerCP/Cy5.5	Biolegend	300430	克隆号 UCHT1
CD56-PC7	Beckman Coulter	A21692	克隆号 N901
CD16-A750	Beckman Coulter	A66330	克隆号 3G8
CD4-FITC	Biolegend	300506	克隆号 RPA-T4
CD8-A700	Beckman Coulter	A66332	克隆号 B9.11