测量大鼠大脑中动脉闭塞后脑梗死区域和脑水肿

本文内容

摘要

来源：Frank, D.，等。在一组啮齿类动物脑样本中同时测量卒中后脑水肿、梗死区域及血脑屏障破坏。J. Vis. Exp. (2020)。

本视频演示了如何评估经大脑中动脉阻塞处理的大鼠脑切片中的梗死区域和脑水肿。使用氧化还原染色法识别梗死区域，同时通过图像分析软件中的蓝色滤光片和阈值功能，对受损半脑的梗死区域和水肿进行定量分析。

方案

所有涉及动物样本的实验程序均已通过相应的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 梗死区域的确定

在大脑中动脉闭塞（MCAO）后24小时测量梗死区（IZ）。
注意：体重减轻超过20%、出现癫痫发作或偏瘫的大鼠将被排除在实验之外。
通过将吸入气体混合物更换为20%氧气和80%二氧化碳，直至大鼠自主呼吸停止，实施安乐死。
使用剪刀和手术镊子，在肋骨下方经腹壁做5-6 cm的侧向切口，打开胸腔。
使用剪刀和手术镊子，沿整个肋骨长度进行膈肌切开。
小心移开肺组织，从左右两侧剪开肋骨直至锁骨。
通过左心室灌注200 mL生理盐水。
用剪刀穿刺或切开右心房。
使用断头器进行断头，并收集脑组织。
使用虹膜剪，从枕骨大孔沿后颅骨表面两侧向远端剪开。
将嗅球、颅骨腹侧和背侧的神经连接与脑组织分离。
将脑组织从头部取出。
使用厚度为0.009英寸的未涂层单边不锈钢剃须刀片，制作2 mm厚的水平切片，共制备6个脑切片。
在0.05% TTC溶液中37 °C孵育30分钟。
将脑组织置于显微镜载玻片上，以1600×1600 dpi分辨率对这6个脑切片进行光学扫描（示例见图1）。
使用图像编辑软件（例如Adobe Photoshop CS2）的通道混合器功能（图像 > 调整 > 通道混合器）添加蓝色滤镜，并将图像保存为JPEG格式。
注意：应用蓝色滤镜后，图像将呈现灰度。
在ImageJ 1.37v中打开已保存的图像。
注意：该软件使用阈值功能来分离并计算纯黑或纯白的像素数量（见图2）。
对于图像中的6个脑切片，使用主菜单中的“多边形选择”工具，分别选择并保存每个半球（右侧受损同侧半球和左侧未受损对侧半球）为独立的图像文件。
通过ImageJ软件主菜单中的自动阈值功能（选择图像 > 调整 > 阈值）设定判断IZ的阈值，并测量单个脑组织每侧半球的像素数量。
注意：此步骤可在ImageJ软件中使用宏程序完成（代码见补充文件1）。阈值是决定根据灰度深浅将像素转换为白色或黑色的关键参数（示例见图3和图4）。ImageJ随后通过比较白色与黑色像素来确定IZ。根据染色方案和扫描仪设置，我们采用0.220的固定阈值。
采用同侧与对侧大脑半球比值法（RICH法）校正组织肿胀对IZ测量的影响（示例见图5）。

注意：梗死体积以对侧半球体积的百分比形式评估。

2. 脑水肿的测定

注意：使用 ImageJ 1.37v 测量脑水肿（BE）。

在MCAO术后24小时测量脑水肿（BE）。计算BE时，使用左侧和右侧半球体积（单位）的数据。
以1600×1600 dpi的分辨率进行光学扫描（示例见图1）。
选择脑半球，并按照上述第1.17–1.19节所述方法，使用ImageJ 1.37v设置用于确定BE的阈值。
将BE面积表示为未受累对侧半球标准面积的百分比，通过RICH方法按以下公式计算（示例见图5）。

注意：脑水肿（BE）的程度以对侧半球的百分比表示。

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材料

本文使用的材料清单
姓名	公司	目录编号	评论
大脑 & 组织基质	Sigma-Aldrich	15013
光学扫描仪	佳能	Cano Scan 4200F	分辨率 3200 x 6400 dpi
培养皿	Sigma-Aldrich	P5606
11号手术刀片	Sigma-Aldrich	S2771
软件
Adobe Photoshop CS2 for Windows	Adobe
ImageJ 1.37v	美国国立卫生研究院		源代码可免费获取。作者 Wayne Rasband（wayne@codon.nih.gov）来自美国马里兰州贝塞斯达市国家精神卫生研究院研究服务部
Office 365 ProPlus	微软	-	Microsoft Office Excel
Windows 10	微软
试剂
2,3,5-三苯基氯化四氮唑	Sigma-Aldrich	298-96-4
2%伊文思蓝	Sigma-Aldrich	314-13-6

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