评估体外血脑屏障模型中的跨内皮细胞电阻

摘要

来源：Kuzmanov, I., 等 一个 体外 利用阻抗谱技术构建血脑屏障模型：聚焦T细胞与内皮细胞的相互作用 视频实验杂志 (2016)

本视频展示了一种在体外评估小鼠脑微血管内皮细胞跨内皮电阻（TEER）的方法。较高的TEER值表明内皮细胞连接完整，而加入活化的T细胞后TEER值降低，反映出连接屏障的破坏。

方案

1. 建立并进行跨内皮电阻（TEER）测量

1. 将跨内皮电阻（TEER）仪器的24孔模块置于超净工作台内。取下盖子，用镊子将含有原代小鼠脑微血管内皮细胞（MBMECs）的插入式培养小室放入模块孔中。
2. 用移液器向模块孔的下层隔室加入810 µl新鲜培养基：小心地将培养基加在插入式小室与模块孔壁之间的间隙中。
3. 盖上盖子，将仪器放入培养箱。将仪器连接至计算机，打开仪器控制器并启动软件。
4. 在弹出窗口中选择“新建测量”。勾选“显示TEER”和“显示Ccl”选项，然后点击“开始”。完成第一次测量后，在“结果”选项卡中选择“检查所有孔”，以查看所有TEER值和细胞层电容（Ccl）值。
5. 保存文件：文件>另存为>“您的文件名”。
   注意：由于TEER和Ccl以自动化方式持续测量，需在三至五天内监测其数值变化。除非通过TEER未升高观察到细胞活力欠佳，否则无需更换培养基。
6. 当Ccl稳定且低于1 µF/cm²，同时TEER达到最大值时，选择此时间点进行MBMECs与T细胞的共培养。
7. 仔细检查各孔的绝对TEER和Ccl数值，并取消勾选未形成足够融合单层的MBMEC孔（即排除这些孔）。
8. 对剩余的孔进行分组：右键单击某一孔，选择“将该孔加入新的平均孔”。在弹出窗口中命名该组；对所有需分组的单个孔重复此操作。
9. 检查所有平均孔，确认共培养前各组初始条件一致。若某些孔的绝对TEER值或TEER斜率存在显著差异，或标准误差过大，则需重新分组。
   注意：理想的孔分组应使实验组内及组间的TEER值变异最小化。
10. 在“实验”选项卡中点击“暂停”，断开仪器连接并将其从培养箱中取出。在超净工作台内取下盖子。
11. 根据需要准备预先活化的和/或初始T细胞，可加入特定细胞因子、抗体或其他物质。例如，将纯化的无内毒素（NA/LE）大鼠抗小鼠干扰素-γ（IFN-γ）抗体（克隆XGM1.2）以每孔20 µg/ml的浓度加入TEER仪器的T细胞悬液中。
    注意：若使用颗粒酶B抑制剂等物质，应在T细胞刺激开始时加入T细胞培养体系中：例如，颗粒酶B抑制剂II（Calbiochem）以10 µM的终浓度溶于二甲基亚砜（DMSO）后与分离的T细胞混合。
12. 从插入式小室（上层孔室）中移除部分培养基。示例：小心吸取150 µl培养基（避免完全移除，以防破坏MBMEC单层结构）。
13. 通过移液器小心加入含2 × 10⁵个细胞/插入式小室的150 µl细胞悬液，使T细胞与MBMECs共培养。
    注意：收获预先活化的T细胞时，仅计数活化的、拒染台盼蓝的细胞。
14. 盖上盖子，将仪器放回培养箱。重新连接仪器并点击“继续测量”。24小时后，在“实验”选项卡中点击“停止”，并保存文件（文件>保存）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
cellZscope	nanoAnalytics GmbH	www.nanoanalytics.com	包含：24孔细胞模块、控制器、配备cellZscope软件v2.2.2的PC
Transwell膜插件 - 孔径0.4 µm	Corning	3470	用于以TEER测量为主要读数
Transwell膜插件 - 孔径3 µm	Corning	3472	用于T细胞跨膜迁移实验前的质量控制TEER测量
24孔细胞培养板	Greiner	650 180	平底；用于MBMEC培养
96孔细胞培养板	Costar	3526	圆底；用于免疫细胞培养
Neubauer计数室	Marienfeld	MF-0640010	用于细胞计数
人胎盘来源IV型胶原蛋白	Sigma	C5533	用于MBMEC包被溶液
牛血浆来源纤连蛋白	Sigma	F1141-5MG	用于MBMEC包被溶液
DMEM（含GlutaMAX）	Gibco	31966-021	用于MBMEC分离及MBMEC培养基
青霉素/链霉素	Sigma	P4333	用于MBMEC分离及MBMEC培养基
肝素	Sigma	H3393	用于MBMEC培养基
人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）	PeproTech	100-18B	用于MBMEC培养基
IMDM + 1% L-谷氨酰胺	Gibco	21980-032	用于T细胞培养基
重组小鼠IFN-γ	PeproTech	315-05	用于T细胞跨膜迁移实验
重组小鼠TNF-α	PeproTech	315-01A	用于T细胞跨膜迁移实验
NA/LE纯化抗小鼠IFN-γ抗体	BD Biosciences	554408	克隆XMG1.2；推荐终浓度：20 µg/mL
颗粒酶B抑制剂II	Calbiochem	368055	推荐终浓度：10 µM
PE标记抗小鼠CD4抗体	Biolegend	116005	克隆RM4-4；用于T细胞跨膜迁移分析
台盼蓝溶液，0.4%	Thermo Fisher Scientific	15250061	用于细胞计数