小鼠脑基底前脑Meyner核内神经纤维的免疫组织化学染色

摘要

来源：Singh, P.，等。小鼠脑基底前脑Meynert核内胆碱能纤维长度的体视学估算。J. Vis. Exp. (2020)

本视频展示了小鼠脑切片中 Meynert 基底核区域胆碱能纤维的免疫组织化学染色。切片经封闭后，使用抗胆碱乙酰转移酶的一抗孵育，随后加入生物素标记的二抗。添加亲和素-生物素-过氧化物酶复合物，使其与二抗结合，再加入显色底物。染色完成后，切片经脱水、封片，最后在显微镜下观察。

方案

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 灌注与组织处理

1. 使用氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）进行腹腔注射以麻醉小鼠。在继续操作前，轻捏脚趾以确认无反应。
2. 经心脏灌注约 50 mL 冰冷的 0.1 M Dulbecco 磷酸盐缓冲液（DPBS），随后灌注 0.1 M 磷酸盐缓冲液（PB）中含 4% 多聚甲醛（PFA）的溶液。
   注意：PFA 具有毒性。操作时需佩戴个人防护装备（PPE）。
3. 取出脑组织并浸入 4% PFA 的 0.1 M PB 溶液中，于 4 °C 下后固定 24 小时。用 DPBS 洗涤 3 次。
4. 将组织转移至 0.1 M DPBS 中含 15% 蔗糖的溶液中过夜，随后转移至 0.1 M DPBS 中含 30% 蔗糖的溶液中，于 4 °C 下继续孵育 48 小时。
5. 从蔗糖溶液中取出组织，在预设温度为 -20 °C 的冷冻切片机腔室内速冻。冷冻样本可保存于密封管中，置于 -80 °C 冰箱中直至切片。
6. 将组织包埋于最佳切割温度包埋介质（见材料表）中，并固定于样本托盘上。使用冷冻切片机在冠状面上连续切取 30 µm 厚的切片，并将所有切片依次收集至含有冷冻保护液（30% 甘油、30% 乙二醇、40% DPBS；图 1A–C）的 24 孔细胞培养板中。储存于 -20 °C 冰箱中。
   备注：在条件允许时，较厚的切片（例如 50 µm）更为理想。确保切片保持切割顺序，且所有切片完全浸没于冷冻保护液中。可选用 96 孔板替代 24 孔板用于收集切片。
7. 用封板膜覆盖孔板以防止蒸发和干燥。将孔板储存在 -20 °C 冰箱中以备后续使用。在 -20 °C 下储存的切片用于胆碱乙酰转移酶（ChAT）免疫组织化学染色时可稳定保存数月。

2. 免疫组化系统性切片选择

注意： 应先进行预实验，以确定获得可接受的抽样误差系数（CE）所需的总切片数量。CE 值用于表示抽样过程中总误差量，数值越低表示误差越小，本实验所用软件认为 CE 值低于 0.1 即为可接受（参见材料表）。

1. 通过将形态学特征与标准小鼠脑图谱（如 Franklin 和 Paxinos）进行比较，确定每只脑组织的起始和终止切片位置。Meynert 基底核（NBM）起始于前囟 -0.0 mm，终止于 -1.6 mm。因此，大约包含 50 个切片。切片总数是体视学分析中所需的一个参数。在预实验中，每隔 8^th 个切片取样一次（SSF = 1/8），共获得 6–7 个切片用于分析，该取样策略在体积估算和纤维长度估算中均产生了可接受的 CE 值。
2. 从最前部的八个切片中随机选择一个作为起始切片，然后系统地每隔 8^th 个切片取样一次，直至包含 NBM 的最后一个后部切片（图 1C）。

3. 免疫组织化学

1. 将冷冻保存的切片转移至含有冷冻保护剂的6孔板中，于室温下平衡，随后转入0.1 M磷酸缓冲液（PB）中。
2. 用PB洗3次。
3. 在 0.3% H₂O₂ 中孵育₂O₂ 在甲醇中放置15分钟。
4. 用TBS洗涤3次。
5. 在含0.25% Triton X-100的TBS中孵育30分钟。
6. 用含10%正常牛血清（NBS）和0.1% Triton X-100的TBS溶液封闭30分钟。
7. 用1:1,000稀释的山羊抗人ChAT一抗孵育（参见 材料表在含0.1% Triton X-100和1% NBS的TBS中，4 °C下孵育48小时。
8. 室温下用TBS洗涤3次。后续所有孵育和洗涤步骤均在室温下进行。
9. 孵育生物素标记的牛抗山羊二抗（参见 材料表1小时。
10. 用 TBS 洗涤 3 次。
11. 与亲和素-生物素-过氧化物酶复合物孵育（参见 材料表).
12. 用TBS洗涤3次。
13. 使用增强型DAB过氧化物酶底物溶液显色（参见 材料表按照制造商的建议进行。
    警告： DAB 为疑似致癌物，可通过接触和吸入引起中毒。操作 DAB 时应使用个人防护装备（PPE）。
14. 用蒸馏水洗涤切片数次，并置于 Tris（pH = 7.6）中保存。
15. 将切片贴附于明胶包被的载玻片上。同一组织的所有切片可置于同一张载玻片上。切片自然晾干后，依次用70%、90%、95%和100%乙醇各脱水两次，每次5分钟，随后用二甲苯清洗两次，每次10分钟以透明化切片。最后使用封片剂（参见 材料表).
    注意： 脱水和透明的处理时间会影响切片的厚度，因此所有切片应采用相同的处理条件。本研究中，切片最终厚度的平均值为21.11 ± 0.45 µm。
16. 将切片置于通风橱中干燥。干燥后的切片可用于体视学分析。

结果

图1：本研究中组织处理与取样方法示意图。样本制备与取样。（A）在将脑组织固定于样品盘之前，先去除小脑和嗅球。（B）脑组织在样品盘上的定位，用于切片。一侧半球上的浅层纵向切口（以线条标示）有助于在切片中识别脑组织的左右侧。（C）24孔板的示意图，显示从24孔板中系统性选取每第8个切片（以“X”标记）。（D）冠状切面的示意图，标示出在系统选取的六个切片中NBM的边界。（E–G）代表性冠状切片图像，经ChAT免疫染色，并标示NBM位置（轮廓线标出）。（H）高倍镜图像，显示NBM的边界。LV = 侧脑室；VL = 丘脑腹外侧核；ic = 内囊；GP = 苍白球；CPu = 尾状壳核（纹状体）；NBM = Meynert基底核（在Franklin和Paxinos...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ABC试剂盒	Vector Laboratories	PK6100
抗ChAT抗体	Millipore, MA, USA	AB144P
牛抗山羊IgG-B	Santacruz Biotechnology	SC-2347
成年牛血清	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	B9433
冷冻切片机	Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA
杜氏磷酸盐缓冲液	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	D5652
乙二醇	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	324558
甘油	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	G2025
过氧化氢	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	H1009
Immpact-DAB试剂盒	Vector Laboratories	SK4105	增强型DAB过氧化物酶底物溶液
氯胺酮	Westward Pharmaceuticals, NJ, USA	0143-9509-01
显微镜	Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA	AF6000	配备电动载物台和IMI-tech彩色数字相机
最佳切割温度（O.C.T.）包埋介质	Electron Microscopy Sciences, PA, USA	62550-12
多聚甲醛	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	P6148
Permount封片介质	Electron Microscopy Sciences, PA, USA	17986-01
吐温X-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T8787
Trizma碱	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T1503	Tris碱
Trizma盐酸盐	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T5941	Tris盐酸盐
赛拉嗪	Bayer, Leverkusen, Germany	Rompun
二甲苯，组织学级	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	534056