使用放射性标记的多巴胺测量小鼠脑突触体中的多巴胺摄取

摘要

来源：Jensen， K. L.， et al.， 通过使用高效液相色谱分析和突触体多巴胺摄取评估小鼠的多巴胺能稳态。J. Vis. Exp. （2017）.

该视频演示了从小鼠大脑中收获的突触体中多巴胺摄取的评估。它概述了准备突触体通过多巴胺转运蛋白摄取多巴胺的步骤，用不同浓度的放射性标记多巴胺处理它们，分离突触体，以及测量放射性以量化多巴胺摄取。

方案

1. 突触体多巴胺摄取

注意：该协议用于两个大脑的平行评估，但它也可以成功地用于四个大脑并行进行突触体多巴胺 （DA） 摄取实验。

1. 准备
   1. 根据表 48 标记 1.5 个 1.5 mL 微量离心管（每个大脑 24 个）。对属于每个大脑的试管使用不同的颜色，以防止样品之间的混淆。
   2. 标记 51 个闪烁管 #1-51。
   3. 将磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 置于冰上。这将用于保持大脑冷却。
   4. 打开离心机，使其预冷至 4 °C。
   5. 在突触体制备过程中，预先称量两个微量离心管以获得准确的组织重量（第 2.6 节）。
   6. 通过混合 4 mM HEPES 和 0.32 M 蔗糖来制备匀浆缓冲液。将 pH 值调节至 7.4 并保持在冰上><。 注意：均质缓冲液可以等分保存在-20°C下，并在实验当天解冻。
   7. 通过混合以下物质制备摄取缓冲液：25 mM HEPES、120 mM NaCl、5 mM KCl、1.2 mM CaCl₂、1.2 mM MgSO₄、1 mM 抗坏血酸 （0.194 g/L）、5 mM D-葡萄糖 （0.991 g/L）。用 NaOH 将 pH 值调节至 7.4（导致钠浓度约为 130 mM）并保持在冰上。
      注意：对于 2 个大脑，准备 1500 mL 摄取缓冲液。将摄取缓冲液制备为不含抗坏血酸和葡萄糖的 10x 储备溶液，保存在 4 °C 下。当天新鲜制备 1x 工作溶液，补充抗坏血酸和葡萄糖。用 NaOH 将 pH 调节至 7.4。
   8. 通过组合以下物质制备摄取缓冲液 + 配体：25 mM HEPES、120 mM NaCl、5 mM KCl、1.2 mM CaCl₂、1.2 mM MgSO₄、1 mM 抗坏血酸 （0.194 g/L）、5 mM D-葡萄糖 （0.991 g/L）、1 μM 帕吉林、100 nM 地昔帕胺、10 nM 儿茶酚-O-甲基转移酶 （COMT） 抑制剂。用 NaOH 调节至 pH 7.4 并保持在冰上><。 注意：使用 50 mL 摄取缓冲液并添加配体。添加 Pargyline 以帮助防止 DA 通过单胺氧化酶 （毛） 氧化而降解。添加 COMT 抑制剂 （RO-41-0960） 以防止 DA （一般为儿茶酚胺） 通过 COMT 降解。添加地昔帕明以抑制通过去甲肾上腺素和血清素转运蛋白的摄取，从而使摄取结果对多巴胺转运蛋白 （DAT） 具有特异性。
   9. 通过混合以下物质制备摄取缓冲液 + 配体 + 可卡因 （coc）：25 mM HEPES、120 mM NaCl、5 mM KCl、1.2 mM CaCl₂、1.2 mM MgSO₄、1 mM 抗坏血酸 （0.194 g/L）、5 mM D-葡萄糖 （0.991 g/L）、1 μM pargyline、100 nM 地昔帕明、10 nM COMT 抑制剂、500 μM 可卡因。用 NaOH 将 pH 值调节至 7.4 并保持在冰上><。 注意：使用 7 mL 摄取缓冲液 + 配体并加入可卡因。添加可卡因以获得非特异性 DA 摄取的背景测量值，以从数据中减去，只留下 DAT 特异性摄取（因为 SERT 和 NET 被地昔帕明抑制，如上所述）。或者，可以使用高效和特异性的 DAT 抑制剂 GBR-12935 来代替。
      重要提示：从现在开始，一切都在冰上。
2. 突触体制备
   1. 通过颈椎脱位和斩首一次处死一只小鼠。
   2. 用剪刀剪开皮肤，露出头骨，并切掉头骨后留下的头骨后方多余的组织。用小直剪刀沿着矢状缝合线剪开头骨，尽可能向前。
   3. 将两个剪刀尖放在鼠标的每只眼睛中，切开头骨，以去除剩余的头骨和完整的大脑。快速取出大脑并将其放入冰冷的 PBS 中。这将在解剖第二个大脑时保持低温。
   4. 使用脑基质，解剖纹状体的 3 毫米冠状切片（前后：+1.5 毫米至 -1.5 毫米），然后用打孔机进行更精细的解剖。冲孔区域见图 1。
   5. 始终将组织放在冰上，向前移动。
   6. 将组织转移至 1.5 mL 微量离心管中进行称重><。 注意：此权重将在步骤 1.2.14 中使用。
   7. 对第二个大脑重复步骤 1.2.1-1.2.6。
   8. 一旦获得两个大脑的重量，将组织转移到含有 1 mL 冰冷匀浆缓冲液的匀浆杯中。
   9. 使用电机驱动杵以 800 rpm 的速度匀浆组织，均匀冲程 10 次。
      注意：一次划程等于一次上下动作。第一次冲程应约为 5 s，接下来是 3-4 s。在等渗培养基中匀浆对于防止突触体破裂很重要。使用适当的力和等渗介质将使突触前末梢重新密封封闭的细胞质、突触囊泡、线粒体和细胞骨架。
   10. 将匀浆转移到 1.5 mL 微量离心管中，然后用 0.5 mL 额外的匀浆缓冲液冲洗，从均质杯中收集剩余的匀浆。
   11. 将样品放在冰上，同时将来自另一个大脑的组织均质化。在步骤 1.2.12-1.2.13 中并行运行两个大脑。
   12. 通过离心（1,000 x g，10 分钟，4°C）沉淀细胞核和细胞碎片。
   13. 将上清液 （S1）（包含细胞膜和细胞质）转移到新的 1.5 mL 微量离心管中，并在 4°C 下以 16,000 x g 离心 20 分钟。
   14. 弃去上清液（含有细胞质），将沉淀 （P2）（含有粗突触体）重悬于 40 μL 匀浆缓冲液/mg 组织中（基于步骤 1.2.6 中获得的重量）。用 p1000 移液管轻轻重悬粗突触体组分，因为用力过大会破坏突触体><。 注意：重要的是，最终至少得到 280 μL。否则，需要用超过 40 μL 的浓度/mg 进行稀释。步骤 1.2.1-1.2.13 必须尽快执行，并且一切都必须保持在冰上。一旦粗突触体重悬于匀浆缓冲液中，只要将它们保存在冰上，它们就相当稳定。

2. 摄取实验

1. 将 440 μL 摄取缓冲液 + 配体 + 可卡因添加到指定的 12 个 1.5 mL 微量离心管中，将 440 μL 摄取缓冲液 + 配体添加到剩余的 36 个 1.5 mL 微量离心管中（布局见表 1<）。 注意：在实验开始前 15 分钟将它们从冰中取出以使其达到室温，但在此之前保持冰上以保存抑制剂。
2. 准备饱和曲线（各种终浓度（0.031、0.0625、0.125、0.25、0.5、0.5 和 1.0 μM）的多巴胺 （2、5、6-[3H]-DA）（3-H 多巴胺）（91.1 Ci/mmol））。
   1. 将 6 个 2 mL 微量离心管标记为 10、5、2.5、1.25、0.62 和 0.31。
   2. 将 750 μL 摄取缓冲液 + 配体添加到数量最少的 5 个微量离心管中。
   3. 将 1,455.4 μL 摄取缓冲液 + 配体、14.6 μL 多巴胺 （1 mM）、30 μl 3-H 多巴胺 （11 μM） 添加到标记为 10 的试管中。
   4. 将 750 μL 从标有 10 的试管中转移到标有 5 的试管中。充分混匀，并将 750 μL 从该试管转移到 2.5 试管中。用剩余的试管重复此稀释。
3. 将玻璃微纤维过滤器置于 12 孔过滤桶中后，用 4 mL 吸收缓冲液预冲洗玻璃微纤维过滤器。
4. 将 10 μL 突触体膜悬液添加到含有 440 μL 缓冲液的前 24 个 1.5 mL 微量离心管中（布局见表 1）。小心涡旋并快速旋转以确保突触体浸没在缓冲液中。在 37 ^°C 下放置 10 分钟
   注意：重要的是要准确计算摄取实验期间的时间，以便在大脑之间进行公平的比较。使用秒表以获得精度。
5. 向前两列中添加 50 μL 浓度为 10 和 5 μM（第 2.2 节）的多巴胺，并在 37 ^°C 下摇动 5 分钟。5 分钟后，加入 1 mL 冰冷的摄取缓冲液终止反应。对浓度 2.5 和 1.25 μM（第 2.2 节）进行相同作，然后对浓度 0.62 和 0.31 μM 执行相同作。
6. 将样品添加到预先冲洗的超细纤维过滤器中，并用 5 x 4 mL 冰冷的摄取缓冲液洗涤。将前 12 个样品添加到滤光片后，将滤光片移至闪烁管。对接下来的 12 个样品重复此作。
7. 对下一个大脑重复步骤 2.4-2.6。
8. 通过在闪烁管 49-51 的底部放置超细纤维过滤器并在顶部添加 25 μL 的最大多巴胺浓度 （10 μM），准备 3 个最大计数管。
9. 将所有 51 个闪烁管在通风橱中放置 1 小时。
10. 向每个闪烁管中加入 3 mL 闪烁液，并在振荡器上剧烈摇晃 1 小时。
11. 在 β 计数器中计数 [³H]-DA 1 分钟。
    1. 打开程序并选择：标签：H-3，板/过滤器：4 mL 样品瓶，4 x 6，检测类型：正常和计数时间：1 min.
       注意：如果更方便，可以在第二天执行此步骤。将样品用锡箔纸覆盖过夜。
12. 蛋白质测定
    1. 使用标准 BCA 蛋白检测试剂盒测定突触体的蛋白质浓度，以便从每分钟计数 （cpm） 调整为 fmol/min/μg，并正确比较样品之间的摄取。

3. 数据分析

1. 使用摄取实验的数据为每组绘制饱和曲线，并计算反应速率 （V_max） 和 Michaelis Menten 常数 （K_M<）。 注意：K_M 值反映了达到 V_max 的一半所需的底物浓度。因此，V_max 直接反映了 DAT 的功能（最大摄取能力），它取决于表面上 DAT 的数量以及其活性如何被翻译后修饰和/或相互作用蛋白以及离子梯度的改变调节。K_M 值是转运蛋白底物亲和力的间接量度，重要的是，转运蛋白也可以通过翻译后修饰和/或相互作用蛋白进行调节。因此，为了充分评估功能变化，重要的是通过例如表面生物素化测定直接确定表面表达水平。

表 1：用于突触体制备的微量离心管布局。

<表格border="1" fo：keep-together.within-page="1" fo：keep-with-next.within-page="always"> 10 5 2,5 1,25% 0,62 0,31 10 5 2,5 1,25% 0,62 0,31 10 5 2,5 1,25% 0,62 0,31 10+碳化硅 5+碳化硅 2.5+碳化硅 1.25+碳化硅 0.62+碳化硅 0.31+碳化硅

结果

图 1：描述突触体 DA 摄取实验方案中不同步骤的工作流程示意图。通过颈椎脱位处死小鼠，然后进行脑解剖并放置在脑基质中。从大脑中解剖出 3 毫米厚的冠状切片，并通过双侧打孔胼胝体正下方的一小块区域进行精细解剖。通过机械破碎将背侧纹状体在 1 mL 匀浆缓冲液中匀浆，然后低速离心 10 分钟。将上清液转移至干净的试管中并高速离心 20 分钟。将含有突触体的沉淀重悬并准备进行摄取实验。通过加入一式三份的不同 [³H] -DA 浓度进行摄取，终浓度范围为 0.031 至 1 μM。此外，将不同浓度的氚化 DA 添加到含有 500 μM 可卡因的对照样品中。最后，在 β 计数器中对样品进行计数，并进行数据分析，揭示 DAT 的饱和曲线。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
COMT 抑制剂	Sigma Aldrich， 德国	RO-41-0960	突触体 DA 摄取方案
[3H]-多巴胺	Perkin-Elmer Life Sciences， 美国马萨诸塞州波士顿	NET67-3001MC	突触体 DA 摄取方案
玻璃超细纤维过滤器	GF/C Whatman，GE Healthcare Life Sciences，白金汉郡	1822-024	突触体 DA 摄取方案
HiSafe 闪烁液	珀金·埃尔默	1200-437	突触体 DA 摄取方案
微贝塔2	珀金·埃尔默		突触体 DA 摄取方案
BCA 蛋白检测试剂盒	Thermo Scientific Pierce	23225	突触体 DA 摄取方案
HEPES	Sigma Life Science	编号： H3375	突触体 DA 摄取方案
蔗糖	Sigma 生命科学	S7903	用于突触体 DA 摄取方案
氯化钠	Sigma 生命科学	S3014	突触体 DA 摄取方案
KCl	Sigma 生命科学	货号 P9541	突触体 DA 摄取方案
氯化钙2	默克公司	10043-52-4	突触体 DA 摄取方案
硫酸镁4	Sigma 生命科学	63065	突触体 DA 摄取方案
抗坏血酸	Sigma 生命科学	编号 A0278	突触体 DA 摄取方案
D-葡萄糖	Sigma 生命科学	编号 G7021	突触体 DA 摄取方案
帕吉林	西格玛·奥尔德里奇	货号 P-8013	突触体 DA 摄取方案
地昔帕明	西格玛·奥尔德里奇	编号 D3900	突触体 DA 摄取方案
多巴胺	Sigma 生命科学	编号 H8502	突触体 DA 摄取方案
可卡因	Sigma 生命科学	货号 C5776	突触体 DA 摄取方案
脑矩阵	ASI 仪器	RBM2000C	突触体 DA 摄取方案
Cafano 机械特氟龙干扰器	Buch & Holm	停产	突触体 DA 摄取方案（均质化）