使用放射性标记多巴胺测量小鼠脑突触体中的多巴胺摄取

摘要

来源：Jensen, K. L.，等，利用高效液相色谱分析和突触体多巴胺摄取评估小鼠多巴胺能稳态。J. Vis. Exp. (2017)。

本视频演示了从小鼠脑组织中分离的突触体中评估多巴胺摄取的方法。该方法包括通过多巴胺转运体准备用于多巴胺摄取的突触体，用不同浓度的放射性标记多巴胺处理突触体，分离突触体，并通过测量放射性来定量多巴胺的摄取量。

方案

1. 突触体多巴胺摄取

注意：本方案适用于同时检测两个脑组织，但也可成功用于同时对四个脑组织进行突触体多巴胺（DA）摄取实验。

1. 样品制备
   1. 每组标记48个1.5 mL微量离心管 表1 （每个大脑24个管）。为每个大脑对应的管子使用不同颜色，以防止样品间混淆。
   2. 标记51个闪烁计数管，编号为1-51。
   3. 将磷酸盐缓冲液（PBS）置于冰上，用于保持脑组织低温。
   4. 开启离心机，使其预冷至 4 °C。
   5. 预先称量两个微量离心管，以便在突触体分离制备过程中（第2.6节）获得组织的精确重量。
   6. 通过混合4 mM HEPES和0.32 M蔗糖配制匀浆缓冲液。调节pH至7.4，并置于冰上保存。
      注意： 匀浆缓冲液可分装后于 -20 °C 保存，并在实验当天解冻使用。
   7. 通过混合以下成分制备摄取缓冲液：25 mM HEPES、120 mM NaCl、5 mM KCl、1.2 mM CaCl₂₂，1.2 mM MgSO₄₄，1 mM 抗坏血酸（0.194 g/L），5 mM D-葡萄糖（0.991 g/L）。用 NaOH 调节 pH 至 7.4（导致钠离子浓度约为 130 mM），并置于冰上保存。
      注意： 对于2个脑组织，准备1500 mL摄取缓冲液。将摄取缓冲液配制成不含抗坏血酸和葡萄糖的10倍储存液，置于4 °C保存。于当日新鲜配制1倍工作液，并添加抗坏血酸和葡萄糖。用NaOH调节pH至7.4。
   8. 将以下成分混合以配制含配体的摄取缓冲液：25 mM HEPES、120 mM NaCl、5 mM KCl、1.2 mM CaCl₂₂，1.2 mM MgSO₄₄，1 mM 抗坏血酸（0.194 g/L），5 mM D-葡萄糖（0.991 g/L），1 μM 反苯环丙胺，100 nM 去甲替林，10 nM 儿茶酚-O-甲基转移酶（COMT）抑制剂。用 NaOH 调节 pH 至 7.4，并置于冰上保存。
      注意： 使用50 mL摄取缓冲液并加入配体。添加帕吉林（pargyline）以抑制单胺氧化酶（MAO）介导的多巴胺（DA）氧化降解。加入儿茶酚-O-甲基转移酶抑制剂（COMT抑制剂，RO-41-0960）以防止DA（以及一般儿茶酚胺类物质）通过COMT途径降解。加入去甲替林（desipramine）以抑制去甲肾上腺素和5-羟色胺转运体的摄取作用，从而使摄取结果特异性地反映多巴胺转运体（DAT）的活性。
   9. 配制含有配体和可卡因（coc）的摄取缓冲液：将以下成分混合，即 25 mM HEPES、120 mM NaCl、5 mM KCl、1.2 mM CaCl₂₂，1.2 mM MgSO₄₄，1 mM 抗坏血酸（0.194 g/L），5 mM D-葡萄糖（0.991 g/L），1 μM 苯乙肼，100 nM 去甲替林，10 nM 儿茶酚-O-甲基转移酶抑制剂，500 μM 可卡因。用 NaOH 调节 pH 至 7.4，并置于冰上保存。
      注意： 使用7 mL摄取缓冲液加配体，并加入可卡因。加入可卡因是为了获得非特异性多巴胺（DA）摄取的背景值，以便从数据中扣除，从而仅保留多巴胺转运体（DAT）特异性的摄取信号（如上所述，去甲替林可抑制5-羟色胺转运体SERT和去甲肾上腺素转运体NET）。或者，也可使用高效且特异性的DAT抑制剂GBR-12935替代可卡因。
      重要提示：从此步骤开始，所有操作均需在冰上进行.
2. 突触体的制备
   1. 每次处死一只小鼠，采用颈椎脱位法并进行断头。
   2. 使用剪刀切开皮肤以暴露颅骨，并剪除颅骨后部因断头所残留的多余组织。用小型直剪刀沿颅骨纵向剪开 矢状缝， 尽可能靠前地结束。
   3. 将剪刀的两个尖端分别插入小鼠双眼，剪开颅骨以移除剩余的颅骨并取出完整的大脑。迅速取出大脑并置于冰冻的PBS中，以便在解剖第二只大脑时保持低温。
   4. 使用脑矩阵切取纹状体的3 mm冠状切片（前后方向：+1.5 mm至-1.5 mm），随后用打孔器进行更精细的分离。参见 图1 用于打孔区域。
   5. 始终将组织置于冰上保存。
   6. 将组织转移至1.5 mL微量离心管中称重。
      注意： 该重量将用于步骤 1.2.14。
   7. 对第二个大脑重复步骤 1.2.1–1.2.6。
   8. 在获得两个脑组织的重量后，将组织转移至含有1 mL预冷匀浆缓冲液的匀浆玻璃管中。
   9. 使用电动研杵以800 rpm的速度匀浆组织，上下研磨10次，力度均匀。
      注意： 一次研磨动作包含一次上下运动。首次研磨时间应约为5秒，后续每次3-4秒。在等渗介质中进行匀浆至关重要，可防止突触体破裂。使用适当的力度和等渗介质，可使突触前末梢重新封闭，包裹胞质、突触小泡、线粒体及细胞骨架。
   10. 将匀浆液转移至1.5 mL微量离心管中，并用0.5 mL额外的匀浆缓冲液冲洗匀浆玻璃器皿，收集残留的匀浆液。
   11. 在另一只动物脑组织匀浆过程中，将样品置于冰上保存。两个脑组织样本在步骤1.2.12–1.2.13中平行处理。
   12. 通过离心沉淀细胞核和细胞碎片（1,000 × g，10 分钟，4°C）。
   13. 将上清液（S1）（含细胞膜和细胞质）转移至新的1.5 mL微量离心管中，在4°C下以16,000 × g离心20分钟。
   14. 弃去上清液（含细胞质），将沉淀（P2，含粗制突触体）按每毫克组织加入40 μL匀浆缓冲液重悬（组织重量依据步骤1.2.6所得）。使用1000 μL移液器轻柔重悬粗制突触体组分，用力过大会导致突触体破裂。
       注意： 最终体积应至少达到280 μL。若不足，则需按每毫克组织加入超过40 μL的缓冲液进行稀释。步骤1.2.1–1.2.13必须尽快完成，所有操作均需在冰上进行。一旦粗制突触体在匀浆缓冲液中重新悬浮，只要保持在冰上，其稳定性较好。

2. 摄取实验

1. 在指定的12个1.5 mL微量离心管中加入440 μL摄取缓冲液 + 配体 + 可卡因，在其余36个1.5 mL微量离心管中加入440 μL摄取缓冲液 + 配体（参见表1中的布局）。
   注意：实验开始前15分钟将这些管子从冰上取出，使其恢复至室温，但在使用前仍需保持在冰上以保护抑制剂的活性。
2. 制备饱和曲线（多巴胺（2,5,6-[3H]-DA）（3-H多巴胺）（91.1 Ci/mmol）在不同终浓度（0.031、0.0625、0.125、0.25、0.5和1.0 μM）下的测定）。
   1. 将六个2 mL微量离心管分别标记为10、5、2.5、1.25、0.62和0.31。
   2. 向编号最小的5个微量离心管中各加入750 μL摄取缓冲液 + 配体。
   3. 向标记为10的管中加入1,455.4 μL摄取缓冲液 + 配体、14.6 μL多巴胺（1 mM）和30 μL 3-H多巴胺（11 μM）。
   4. 从标记为10的管中转移750 μL至标记为5的管中，充分混匀后，再从中转移750 μL至标记为2.5的管中。以此方式依次对剩余各管进行系列稀释。
3. 将玻璃微纤维滤膜置于12孔滤板上后，用4 mL摄取缓冲液预冲洗滤膜。
4. 向含有440 μL缓冲液的前24个1.5 mL微量离心管中（参见表1中的布局）各加入10 μL突触体膜悬液。轻轻涡旋混匀，并短暂离心，确保突触体完全浸入缓冲液中。于37 ^oC孵育10分钟。
   注意：为保证不同脑组织样本之间的公平比较，摄取实验中的时间必须精确控制。建议使用秒表以确保准确性。
5. 向第一列和第二列分别加入50 μL浓度为10 μM和5 μM的多巴胺（见第2.2节），在37 ^oC振荡孵育5分钟。精确孵育5分钟后，加入1 mL冰浴预冷的摄取缓冲液终止反应。随后对浓度为2.5 μM和1.25 μM的样本重复该步骤，最后对浓度为0.62 μM和0.31 μM的样本进行相同操作。
6. 将样品加入已预冲洗的微纤维滤膜上，并用5次×4 mL冰浴预冷的摄取缓冲液洗涤。当完成前12个样品的过滤后，将滤膜转移至闪烁管中。对接下来的12个样品重复此操作。
7. 对下一个脑组织样本重复步骤2.4–2.6。
8. 准备3个最大计数管：将微纤维滤膜放入闪烁管49–51底部，并在其上加入25 µL最高浓度的多巴胺溶液（10 μM）。
9. 将全部51个闪烁管置于通风橱中静置1小时。
10. 向每个闪烁管中加入3 mL闪烁液，并在摇床上剧烈振荡1小时。
11. 使用β计数器对[³H]-DA进行1分钟计数。
    1. 打开程序并选择：标记物：H-3，样品容器/滤膜类型：4 mL小瓶，4×6格式，检测类型：常规，计数时间：1分钟。
       注意：若时间安排更方便，此步骤可于次日进行。样品需用锡箔纸覆盖过夜保存。
12. 蛋白浓度测定
    1. 采用标准BCA蛋白检测试剂盒测定突触体的蛋白浓度，用于将每分钟计数（cpm）校正为fmol/min/μg，并实现样本间摄取量的准确比较。

3. 数据分析

1. 利用摄取实验的数据为每组绘制饱和曲线，并计算反应速率（V_max）和米氏常数（K_M）。
   注意： K_M 值反映了达到 V_max 一半时所需的底物浓度。因此，V_max 直接反映了多巴胺转运体（DAT）的功能（即最大摄取能力），该能力取决于细胞表面 DAT 的数量，以及翻译后修饰和/或相互作用蛋白对其活性的调节作用，同时也受离子梯度变化的影响。K_M 值是底物与转运体亲和力的间接衡量指标，该指标同样可受到翻译后修饰和/或相互作用蛋白的调节。因此，为全面评估功能变化，有必要通过例如细胞表面生物素化实验等方法直接测定细胞表面表达水平。

表1：突触体提取用微量离心管布局。

10	5	2.5	1.25	0.62	0.31
10	5	2.5	1.25	0.62	0.31
10	5	2.5	1.25	0.62	0.31
10+coc	5+coc	2.5+coc	1.25+coc	0.62+coc	0.31+coc

结果

图 1：示意图展示突触体多巴胺（DA）摄取实验方案中的各个步骤。 小鼠通过颈椎脱位法处死，随后进行脑组织解剖并置于脑组织切片模具中。从脑组织切取一块3 mm厚的冠状切片，并在胼胝体正下方双侧小区域进行精细解剖。将背侧纹状体组织在1 mL匀浆缓冲液中通过机械破碎进行匀浆，随后以低速离心10分钟。将上清液转移至洁净离心管中，再以高速离心20分钟。含有突触体的沉淀物被重新悬浮，即可用于摄取实验。摄取实验通过加入不同浓度的[³H]-DA进行，每个浓度设三个复孔，终浓度范围为0.031至1 μM。此外，将不同浓度的氚标记DA也加入含500 μM可卡因的对照样品中。最后，使用β计数器对各样品进行计数，并进行数据分析，获得多巴胺转运体（DAT）...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
COMT 抑制剂	Sigma Aldrich, Germany	RO-41-0960	用于突触体多巴胺（DA）摄取实验方案
[3H]-多巴胺	Perkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA, USA	NET67-3001MC	用于突触体多巴胺（DA）摄取实验方案
玻璃微纤维滤膜	GF/C Whatman, GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire	1822-024	用于突触体多巴胺（DA）摄取实验方案
HiSafe 闪烁液	Perkin Elmer	1200-437	用于突触体多巴胺（DA）摄取实验方案
MicroBeta2	Perkin Elmer		用于突触体多巴胺（DA）摄取实验方案
BCA 蛋白检测试剂盒	Thermo Scientific Pierce	23225	用于突触体多巴胺（DA）摄取实验方案
HEPES	Sigma Life Science	H3375	用于突触体多巴胺（DA）摄取实验方案
蔗糖	Sigma Life Science	S7903	用于突触体多巴胺（DA）摄取实验方案
NaCl	Sigma Life Science	S3014	用于突触体多巴胺（DA）摄取实验方案
KCl	Sigma Life Science	P9541	用于突触体多巴胺（DA）摄取实验方案
CaCl2	Merck KGaA	10043-52-4	用于突触体多巴胺（DA）摄取实验方案
MgSO4	Sigma Life Science	63065	用于突触体多巴胺（DA）摄取实验方案
抗坏血酸	Sigma Life Science	A0278	用于突触体多巴胺（DA）摄取实验方案
D-葡萄糖	Sigma Life Science	G7021	用于突触体多巴胺（DA）摄取实验方案
帕吉林	Sigma Aldrich	P-8013	用于突触体多巴胺（DA）摄取实验方案
去甲替林	Sigma Aldrich	D3900	用于突触体多巴胺（DA）摄取实验方案
多巴胺	Sigma Life Science	H8502	用于突触体多巴胺（DA）摄取实验方案
可卡因	Sigma Life Science	C5776	用于突触体多巴胺（DA）摄取实验方案
脑组织切片模具	ASI instruments	RBM2000C	用于突触体多巴胺（DA）摄取实验方案
Cafano 机械特氟龙匀浆器	Buch & Holm	已停产	用于突触体多巴胺（DA）摄取实验方案（匀浆）