大鼠海马脑片中生物胞素标记的中间神经元染色可视化方法

摘要

来源：Economides, G. 等。生物胞素回收及填充的海马CA2区中间神经元的三维重建。J. Vis. Exp. (2018)

本视频演示了对含有生物胞素标记的中间神经元的固定大鼠脑切片进行染色的操作步骤。该实验方案包括与亲和素-生物素复合物（ABC）孵育、使用辣根过氧化物酶（HRP）及显色底物染色、用四氧化锇固定组织结构，以及将组织包埋于树脂中以用于成像。

方案

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准

1. 电生理记录与生物胞素填充后中间神经元钙结合蛋白或蛋白含量的测定及生物胞素显影

注意： 电生理记录结束后，含有生物胞素标记细胞的脑片需在组织学处理前于固定液中固定过夜。若后续步骤需在另一日进行，则次日早晨需用0.1 M磷酸缓冲液更换一次固定液，以防止组织损伤。固定液（4%多聚甲醛、0.2%饱和苦味酸溶液、0.025%戊二醛溶液溶于0.1 M磷酸缓冲液（PB））必须在记录当天新鲜配制，以获得最佳效果。

1. 电生理记录结束后，用画笔小心拾起含有已记录细胞的脑片，放入盛有人工脑脊液（ACSF）的容器中。
   注意： 有关使用锐电极进行脑片制备和细胞内记录的实验方案细节此前已有描述。
2. 在通风橱内，用画笔小心地夹起脑切片，并将其卷至一小片优质滤纸上。将另一片湿润的滤纸覆盖在切片上，随后将两片湿滤纸放入盛有5–10 mL固定液的小型塑料容器中，于4 °C冰箱内过夜保存。
3. 在烧杯中加入20 mL蒸馏水，置于加热板上加热至60 °C。逐渐加入2.4 g明胶，待其完全溶解后，冷却至35–40 °C再使用，以防止对组织造成损伤。
4. 用2 mL的0.1 M磷酸缓冲液替换固定液。将脑片置于....

结果

图1： 海马CA2区记录并填充的两种类型篮状细胞的神经元重建，以及细胞内记录后获得的相关电生理数据 体外此图经由先前研究修改而来。SO 篱状层，SP 锥体细胞层，SR 辐射层，SLM 漏斗状分子层。AAa：使用绘图仪（1000倍）重建树突和轴突分支受限的CA2区篮状细胞。树突以黑色显示，轴突以红色显示。Ab：采用本文所述的亲和素-HRP方法染色后，生物胞素标记的篮状细胞图像。Ac：对树突和轴突分支受限的CA2区篮状.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
亲和素-7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸（Avidin-AMCA）抗体，20.8 mg/mL	Vector laboratories	A2008
生物胞素，≥98%（薄层色谱法）	Sigma	B4261
3,5-二氨基联苯胺（DAB）片剂，用于配制5 mL	Sigma	D4293
Durcupan 环氧树脂 A	Sigma	44611
Durcupan 环氧树脂 B	Sigma	44612
Durcupan 环氧树脂 C	Sigma	44613
Durcupan 环氧树脂 D	Sigma	44614
乙醇，特优级纯，无水，≥99.8%	Sigma	32221
明胶	Sigma	48723
戊二醛溶液，I型，25% 水溶液	Sigma	G5882
甘油，≥99%	Sigma	G5516
山羊血清	Sigma	G9023
山羊抗小鼠异硫氰酸荧光素（FITC）抗体，14.3 mg/mL	Sigma	F2653
山羊抗兔德克萨斯红（TR）抗体，3.3 mg/mL	Invitrogen	T2767
过氧化氢，30% 溶液	Sigma	H-1009
浸油，黏度1.250 cSt（文献值）	Sigma	I0890
氯化镍	Sigma	N5756
四氧化锇，用于电子显微镜，水中4%	Sigma	75632
多聚甲醛，试剂级，结晶状	Sigma	P6148
苦味酸，以水润湿，≥98%	Sigma	197378
磷酸盐缓冲液 1 M	Sigma	P3619
丙烯酸氧化物，99%	Alfa Aesar	30765
四氢硼酸钠	VWR	27885.134
蔗糖	Fisher scientific	S/8600/53
Trizma 盐酸盐，≥99.0%	Sigma	T5941
Trizma 基础缓冲液，≥99.9%	Sigma	T6066
Vectashield 抗荧光淬灭封片剂，折射率1.45	Vector laboratories	H-1000
Vectastain Elite ABC HRP 试剂盒	Vector laboratories	PK6100
使用设备
振动切片机	Agar Scientific
C4A 凹形铝制样品杯	GA-MA & ASSOCIATES, INC.
Leica DMR 显微镜	Leica Microsystems
X-Cite 120PC Q 荧光光源	Excelitas Technologies
Leica DFC450 数码显微相机	Leica Microsystems
0.18 mm 针管式绘图笔	London graphics centre
0.18 mm 针管式绘图笔笔尖	London graphics centre
0.25 mm 针管式绘图笔	London graphics centre
0.25 mm 针管式绘图笔笔尖	London graphics centre
Neurolucida 系统，包括PC工作站、载物台、相机及用于XYZ轴控制的操纵杆	Microbrightfield (MBF) Bioscience
Neurolucida 软件版本 2017	Microbrightfield (MBF) Bioscience
CorelDRAW 图形设计软件 X5	Corel
视频编辑软件	Adobe Premiere Pro
14 mL 玻璃小瓶	Fisher scientific