大鼠海马脑片中生物胞素标记的中间神经元染色可视化方法

摘要

来源：Economides, G. 等。生物胞素回收及填充的海马CA2区中间神经元的三维重建。J. Vis. Exp. (2018)

本视频演示了对含有生物胞素标记的中间神经元的固定大鼠脑切片进行染色的操作步骤。该实验方案包括与亲和素-生物素复合物（ABC）孵育、使用辣根过氧化物酶（HRP）及显色底物染色、用四氧化锇固定组织结构，以及将组织包埋于树脂中以用于成像。

方案

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准

1. 电生理记录与生物胞素填充后中间神经元钙结合蛋白或蛋白含量的测定及生物胞素显影

注意： 电生理记录结束后，含有生物胞素标记细胞的脑片需在组织学处理前于固定液中固定过夜。若后续步骤需在另一日进行，则次日早晨需用0.1 M磷酸缓冲液更换一次固定液，以防止组织损伤。固定液（4%多聚甲醛、0.2%饱和苦味酸溶液、0.025%戊二醛溶液溶于0.1 M磷酸缓冲液（PB））必须在记录当天新鲜配制，以获得最佳效果。

1. 电生理记录结束后，用画笔小心拾起含有已记录细胞的脑片，放入盛有人工脑脊液（ACSF）的容器中。
   注意： 有关使用锐电极进行脑片制备和细胞内记录的实验方案细节此前已有描述。
2. 在通风橱内，用画笔小心地夹起脑切片，并将其卷至一小片优质滤纸上。将另一片湿润的滤纸覆盖在切片上，随后将两片湿滤纸放入盛有5–10 mL固定液的小型塑料容器中，于4 °C冰箱内过夜保存。
3. 在烧杯中加入20 mL蒸馏水，置于加热板上加热至60 °C。逐渐加入2.4 g明胶，待其完全溶解后，冷却至35–40 °C再使用，以防止对组织造成损伤。
4. 用2 mL的0.1 M磷酸缓冲液替换固定液。将脑片置于培养皿中，用手术刀片切除多余的组织。将修整后的组织放入一个培养皿（直径9 cm，高1.4 cm）中，确保其平铺无折叠或皱褶，并用干燥的画笔除去多余的缓冲液。
5. 用预热的明胶溶液覆盖组织，然后将培养皿置于冷冻块上，以快速冷却溶液。
6. 使用可调节角度的台灯提供对比光源，从培养皿侧面观察，同时用细画笔轻轻施压以保持切片平整，直至明胶开始凝固。
   注意： 如果组织未能平整贴附，明胶可重新熔化。在明胶凝固过程中，因移除画笔而在其表面留下的任何瑕疵，可通过将灯泡靠近表面数秒，轻柔熔化表面层予以去除。
7. 将装有凝固明胶的培养皿放入冰箱，在 4 °C 下静置 30–60 分钟。
8. 在通风橱中，使用手术刀片切取含有明胶包埋组织的小块样本（约 1 × 1 cm），用小刮铲轻轻挑起组织块，并小心转移至用于固定切片的相同但新鲜的固定液中，在 4 °C 下固定至少 30 分钟。
9. 用 0.1 M 磷酸缓冲液（PB）清洗明胶块 3 次，每次 5 mL，用滤纸吸干，然后将明胶块向上放置黏附于载玻片上即使用超级胶水将组织（组织朝上）固定到振动切片机的样品夹上。
10. 用滤纸擦去多余的胶水，并用手术刀片切去块状物的四个角，使其呈菱形。
11. 使用振动切片机以50 µm厚度对脑片进行切片，并将每一片小心放入含有10%蔗糖的玻璃小瓶中。
12. 小心地从离心管中取出一个切片，将其平放在培养皿盖内。在解剖显微镜下，使用新的手术刀片去除切片周围的明胶，然后将切片放回含有 2 mL 新鲜 10% 蔗糖溶液的离心管中。
    注意： 此步骤中必须尽可能去除明胶，以减少脱水步骤（步骤1.37）期间的组织收缩。
13. 在室温下，将切片置于基于0.1 M磷酸缓冲液的蔗糖-甘油溶液中进行冷冻保护：先在10%蔗糖溶液中孵育10分钟，随后在20%蔗糖-6%甘油溶液中振荡孵育20分钟，重复两次，最后在30%蔗糖-12%甘油溶液中振荡孵育30分钟，重复两次。
14. 用画笔将切片平放在一小块锡箔纸上。去除切片上多余的液体，然后小心地将锡箔纸折叠成包裹状。
15. 将样本包埋物靠近液氮表面但不接触液氮表面，保持30秒，然后让切片完全解冻约30秒。重复冻融过程两次。
16. 用毛笔移除所有切片，并将其放入含有2 mL 0.1 M PB的玻璃小瓶中，在持续振荡下清洗以去除多余的蔗糖。
17. 用巴斯德移液管移除 PB，将切片在 2 mL 1% 水溶液过氧化氢（H₂O₂）中孵育₂O₂)孵育30分钟。用2 mL 0.1 M PB缓冲液洗涤3次，每次5分钟。
18. 用巴斯德移液管移除 0.1 M PB，加入 1 % 硼氢化钠（NaBH₄）₄) 于 0.1 M PB 中。
    注意： 不要盖紧试管，因为 NaBH₄ 溶液释放氢气。
19. 用巴斯德移液管除去硼氢化钠，并用 2 mL 0.1 M 磷酸缓冲液彻底清洗切片，每次 5 分钟，共洗 5 次。
20. 用含10%正常山羊血清（NGS）的0.1 M PB替代0.1 M PB，孵育30分钟。
21. 去除山羊血清，将切片在4 °C下用ABC溶液配制的小鼠单克隆抗体和兔多克隆抗体混合液孵育过夜。
    注意： 先前研究中使用的一抗列表如下所示 表1.
22. 在避光条件下，将切片置于荧光标记的二抗混合液中孵育 2 h材料表).
23. 将切片置于载玻片上的封片剂中，并加盖盖玻片。
24. 以40倍放大倍数拍摄荧光标记图像（图1Bb).
25. 荧光成像后，将载玻片放入盛有 PBS 的玻璃培养皿中，小心移除盖玻片。然后用巴斯德移液管轻轻吹打 PBS，将切片从载玻片上冲洗下来。将切片转移至含有 PBS 的洁净玻璃小瓶中。
26. 通过首先将切片在ABC溶液中孵育至少2小时以扩增HRP反应产物，进行亲和素-HRP反应。
27. 将一片3,5-二氨基联苯胺（DAB）溶于5 mL蒸馏水中，配制DAB溶液。
28. 用 PBS 洗涤切片 3 次，每次 10 分钟，然后用 Tris 缓冲液洗涤 2 次，每次 10 分钟。最后一次洗涤后移除 Tris 缓冲液。
29. 快速加入一滴8% NiCl₂ 将氯化镍溶液加入DAB溶液中，用移液器吹打混合，迅速将1 mL该溶液加至切片上。将切片在DAB/NiCl₂工作液中孵育₂ 溶液处理15分钟。
30. 加入10 µL 1% H₂O₂ 加入DAB溶液。在避光条件下持续振荡反应约1至2分钟，并在解剖显微镜下观察标记的灌注细胞。
31. 通过移除DAB/NiCl终止反应₂/₂O₂ 溶液中孵育，并用 Tris 缓冲液洗涤切片两次，每次 5 分钟。
32. 在通风橱中，将一小片滤纸放入培养皿内，并用 0.1 M PB 浸润。用画笔逐个从玻璃小瓶中取出切片，小心地将其平铺于滤纸上。
33. 用另一张湿润的滤纸圆片覆盖组织切片，并用纸巾轻轻接触表面以去除多余的缓冲液。
34. 在滤纸顶部加入8–9滴1%四氧化锇（osmium tetroxide）的0.1 M PB溶液，盖上培养皿，置于通风橱中孵育至少30分钟，但不超过1小时。
35. 打开培养皿，提起上层滤纸。用毛笔小心地逐片夹取切片，放入玻璃小瓶中，并用蒸馏水冲洗两次。
36. 妥善处理四氧化锇废液。冲洗所有一次性实验器材，并将其放入指定的废弃物容器中。
37. 将每个切片平放于载玻片上，盖上盖玻片。将载玻片转移至培养皿中，用一个空的玻璃小瓶压在盖玻片上以固定其位置，然后加入50%乙醇覆盖。15分钟后，将载玻片从溶液中取出，并将切片从载玻片上取下。将切片重新放回载玻片上，再将载玻片置于70%乙醇中15分钟。随后依次用95%和100%乙醇溶液重复相同步骤。
38. 脱水步骤完成后，将切片转移至通风橱内摇床上的玻璃小瓶中，瓶内盛有100%乙醇。用丙烯酸氧化物（C₃H₆O）中清洗，每次5分钟，共清洗三次。最后一次清洗后，保留约2 mL丙烯酸甲酯于小瓶中，并加入树脂（体积比1:1）。确保树脂完全溶解，并将切片持续振荡30分钟。
39. 使用木棒将每个样本置于含有环氧树脂的铝制载片中，并过夜孵育。
    注意：不要将切片在树脂中放置超过24小时，以免造成切片损伤。
40. 将载片置于加热板上加热约10分钟。用木棒挑起每个切片，转移至洁净的载玻片上。在解剖显微镜下保持每个切片的方向一致。将盖玻片覆盖在切片上。将载玻片放入56 °C的烘箱中固化48小时。

表1：溶液表。

所用溶液	成分/配制方法
固定液	4% 多聚甲醛，0.2% 饱和苦味酸溶液，0.025% 戊二醛溶液，溶于 0.1 M 磷酸盐缓冲液（PB）中
0.1 M 磷酸盐缓冲液，pH 7.6	取 100 mL 1 M 磷酸盐缓冲液原液，加入 900 mL 蒸馏水中
磷酸盐缓冲盐水（PBS），pH 7.4/7.5	将 10 mL 0.1 M 磷酸盐缓冲液、0.2 g KCl 和 8.76 g NaCl 加入 990 mL 蒸馏水中
TRIS 缓冲液，pH 7.5	将 5.72 g 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris Hydrochloride）和 1.66 g 三羟甲基氨基甲烷碱（Tris Base）溶于 50 mL 蒸馏水中，再加蒸馏水定容至 1 L
缓冲的戊二醛与多聚甲醛固定液	4% 多聚甲醛，0.2% 饱和苦味酸溶液，0.025% 戊二醛溶液，溶于 0.1 M 磷酸盐缓冲液中
ABC 溶液	使用 ABC 试剂盒配制，至少在使用前 30 分钟配制。将溶液 A 和溶液 B 各 1 滴加入 2.5 mL PBS 中
Durcupan 环氧树脂：	配制 20 个样品杯用量：20 g 组分 A，20 g 组分 B，0.6 g 组分 C 和 0.4 g 组分 D-
	用圆形滤纸覆盖天平托盘，防止洒漏。按上述比例将试剂小心称量至三口烧杯中。用两根木棒剧烈搅拌至少 5 分钟，充分混匀。混合物应呈均匀的深棕色。将烧杯置于约 50 °C 烘箱中，最多加热 10 分钟，以尽可能去除气泡。注意：若在烘箱中放置超过 10 分钟，树脂将开始固化。将树脂转移至塑料样品杯或 5 mL 注射器中，标注日期，并储存在 -20 °C 冰箱中备用。

结果

图1： 海马CA2区记录并填充的两种类型篮状细胞的神经元重建，以及细胞内记录后获得的相关电生理数据 体外此图经由先前研究修改而来。SO 篱状层，SP 锥体细胞层，SR 辐射层，SLM 漏斗状分子层。AAa：使用绘图仪（1000倍）重建树突和轴突分支受限的CA2区篮状细胞。树突以黑色显示，轴突以红色显示。Ab：采用本文所述的亲和素-HRP方法染色后，生物胞素标记的篮状细胞图像。Ac：对树突和轴突分支受限的CA2区篮状...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
亲和素-7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸（Avidin-AMCA）抗体，20.8 mg/mL	Vector laboratories	A2008
生物胞素，≥98%（薄层色谱法）	Sigma	B4261
3,5-二氨基联苯胺（DAB）片剂，用于配制5 mL	Sigma	D4293
Durcupan 环氧树脂 A	Sigma	44611
Durcupan 环氧树脂 B	Sigma	44612
Durcupan 环氧树脂 C	Sigma	44613
Durcupan 环氧树脂 D	Sigma	44614
乙醇，特优级纯，无水，≥99.8%	Sigma	32221
明胶	Sigma	48723
戊二醛溶液，I型，25% 水溶液	Sigma	G5882
甘油，≥99%	Sigma	G5516
山羊血清	Sigma	G9023
山羊抗小鼠异硫氰酸荧光素（FITC）抗体，14.3 mg/mL	Sigma	F2653
山羊抗兔德克萨斯红（TR）抗体，3.3 mg/mL	Invitrogen	T2767
过氧化氢，30% 溶液	Sigma	H-1009
浸油，黏度1.250 cSt（文献值）	Sigma	I0890
氯化镍	Sigma	N5756
四氧化锇，用于电子显微镜，水中4%	Sigma	75632
多聚甲醛，试剂级，结晶状	Sigma	P6148
苦味酸，以水润湿，≥98%	Sigma	197378
磷酸盐缓冲液 1 M	Sigma	P3619
丙烯酸氧化物，99%	Alfa Aesar	30765
四氢硼酸钠	VWR	27885.134
蔗糖	Fisher scientific	S/8600/53
Trizma 盐酸盐，≥99.0%	Sigma	T5941
Trizma 基础缓冲液，≥99.9%	Sigma	T6066
Vectashield 抗荧光淬灭封片剂，折射率1.45	Vector laboratories	H-1000
Vectastain Elite ABC HRP 试剂盒	Vector laboratories	PK6100
使用设备
振动切片机	Agar Scientific
C4A 凹形铝制样品杯	GA-MA & ASSOCIATES, INC.
Leica DMR 显微镜	Leica Microsystems
X-Cite 120PC Q 荧光光源	Excelitas Technologies
Leica DFC450 数码显微相机	Leica Microsystems
0.18 mm 针管式绘图笔	London graphics centre
0.18 mm 针管式绘图笔笔尖	London graphics centre
0.25 mm 针管式绘图笔	London graphics centre
0.25 mm 针管式绘图笔笔尖	London graphics centre
Neurolucida 系统，包括PC工作站、载物台、相机及用于XYZ轴控制的操纵杆	Microbrightfield (MBF) Bioscience
Neurolucida 软件版本 2017	Microbrightfield (MBF) Bioscience
CorelDRAW 图形设计软件 X5	Corel
视频编辑软件	Adobe Premiere Pro
14 mL 玻璃小瓶	Fisher scientific