使用径向运动检测法评估 C. elegans 模型中的运动功能障碍

摘要

来源：Currey, H. N. 等，et al. 肌萎缩侧索硬化症 C. elegans 模型中运动功能障碍的评估。J. Vis. Exp. (2021)。

本视频演示了使用径向运动实验评估表达野生型或ALS突变型人类TDP-43蛋白的C. elegans中运动功能障碍的方法。让表达不同水平野生型或突变型TDP-43的线虫自由爬行，并通过其在实验平板上从中心点出发所移动的径向距离来测量其运动能力。该实验根据不同C. elegans品系所移动的距离，区分轻度、中度和重度的运动功能障碍。

方案

1. 径向运动实验

1. 准备直径为 100 mm 或 150 mm 的培养皿，其中加入约半满的线虫生长培养基（NGM），并在表面均匀接种 OP50 细菌，形成覆盖整个琼脂表面的菌苔。
2. 将 NGM 检测平板倒置，在底部标记待检测的 C. elegans 品系编号，每个品系使用 2 个平板（图 1A）。
3. 用记号笔在倒置平板的中心位置做一个小点（图 1A）。
4. 在体视显微镜下操作，使用铂金丝挑取器将 15–20 条发育阶段一致的线虫转移至检测平板中心，正对中心标记点（可通过 NGM 观察到）（图 1B）。
   注意：尽量同时或尽可能快速地完成所有线虫的转移。
   1. 在线虫被放置于平板中心后，设定 30 分钟计时器。盖上平板盖子并将其放置一旁（图 1C）。
5. 继续转移线虫，直至所有品系均被分配至指定的检测平板，并记录在各平板之间转移所需的大致时间（目标为每两个平板之间约 1 分钟）。所有平板应保持最初设置时的顺序。
6. 30 分钟后，开始对第一个平板进行评分。
   1. 取下盖子，将平板倒扣在体视显微镜下，使标记面朝上，NGM 琼脂位于观察视线与线虫之间。此时平板处于与常规使用相反的倒置状态。
   2. 调节显微镜焦距，直至可通过琼脂清晰观察到线虫。
   3. 使用与中心点不同颜色的记号笔，在每条线虫所在位置做一小点标记——沿细菌菌苔中的爬行轨迹寻找最远端的个体。
   4. 检查平板边缘，部分线虫可能已爬至边缘。同时，计数并记录位于中心点标记处的线虫数量（图 1D）。
7. 按顺序继续对所有检测平板进行标记，确保每个平板均有 30 分钟的活动时间，注意补偿设置平板所花费的时间。随后，按照步骤 1.8 或 1.9 所述进行手动或数字化测量。
8. 使用直尺进行手动测量。
   1. 使用直尺以毫米（mm）为单位，测量从中心点到每条线虫最终位置标记的距离，并记录该距离。为便于在评分过程中跟踪进度，可用一条短线标记第一个已评分点。
   2. 通过顺时针旋转平板，依次记录每个点的长度数据（图 1E）。
9. 使用扫描仪和 ImageJ 软件进行数字化测量。
   1. 使用平板扫描仪，将检测平板的背面与一把直尺一同扫描（直尺数字面朝向扫描面）（图 2A）。
   2. 在 ImageJ 或类似程序中打开扫描得到的平板图像。
      ​注意：ImageJ 是由美国国立卫生研究院（NIH）提供的免费基于 Java 的图像处理软件。
   3. 点击直线工具，然后在扫描图像中连接直尺上的 1 cm 和 2 cm 刻度点（图 2B）。
      注意：按住键盘上的Shift键可使所画直线强制对齐至最接近的 45° 角。
   4. 进入分析菜单，使用其设置标尺（分析 | 设置标尺）（图 2C）。
   5. 在相应输入框中填写已知距离（10）和长度单位（mm），不要更改像素距离数值。勾选全局选项，以便将相同标尺应用于每次 ImageJ 会话中所有待分析图像；否则，需在每次打开图像时重新设置标尺（图 2D）。点击确定。
      注意：步骤 1.9.2–1.9.5 用于设定测量标尺。此后，图像中线段长度将自动根据设定的像素与长度关系进行换算。以 300 dpi 分辨率扫描的图像，其像素与毫米的近似换算关系为每毫米约 11.8 像素。
   6. 使用画笔工具在第一个待评分点的正上方做一标记。
      注意：此标记作为第一个已评分线虫的视觉指示。
   7. 使用直线工具，从中心点画一条直线至第一个线虫数据点。
   8. 按下键盘上的M键以测量距离。或者，进入分析菜单并选择测量（分析 | 测量）。两种方式下，测量结果均会出现在新窗口中；该窗口将汇总每幅图像的所有测量数据。
   9. 保持中心点不变，将直线末端从第一个线虫点移动至下一个点（顺时针方向），然后按下M键进行测量。
   10. 继续按顺时针方向逐点测量，直至所有点均被评分。
   11. 复制并粘贴长度测量数据至电子表格中保存。然后，对每张扫描图像重复上述过程。
       ​注意：步骤 1.9.6–1.9.11 用于测量线虫的位移值（图 2E–F）。
10. 进行统计分析。
    1. 将单次实验中的重复样本合并，使总评分线虫数量达到 30–40 条。
    2. 在不同日期使用独立培养的线虫群体进行独立的实验重复，最终获得 3 次独立的实验重复数据。
    3. 采用适当的统计分析方法进行数据分析，例如对两个品系使用 Student t 检验，对三个或更多品系使用单因素方差分析（1-way ANOVA）。

结果

图1：径向运动检测流程图。 图中A-E展示了径向运动检测的一般步骤。具体如下：（A）制备NGM平板，将OP50细菌接种至边缘，并在平板上标记中心点；（B）将线虫放置于琼脂表面的中心点处；（C）让线虫自由移动一段设定的时间；（D）将平板翻转，用不同于中心点的颜色标记每条线虫的最终位置；（E）通过手动或数字化方式测量中心点至每条线虫最终位置的距离。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
C. elegans	秀丽隐杆线虫遗传学中心 (CGC)	-	可根据需要获取菌株，N2 是一种有用的对照菌株
一次性巴斯德吸管，硼硅酸盐玻璃	VWR	14673-010	用于制作线虫挑针的玻璃吸管——一手持玻璃吸管，另一手持镊子夹住约1"长的铂丝，在火焰上加热连接
一次性培养皿，35×10 mm	VWR	10799-192	WormLab 成像系统的检测用培养皿
一次性培养皿，60×15 mm	VWR	25384-090	线虫保种用培养皿
一次性培养皿，100×15 mm	VWR	25384-302	标准径向运动检测培养皿
一次性培养皿，150×15 mm	VWR	25384-326	长时间径向运动检测培养皿
体视显微镜	Leica	M80	用于线虫培养及设置径向运动检测
细头标记笔	VWR	52877-810	径向运动检测至少需要两种颜色，细头笔尖以确保准确性
平板扫描仪	Amazon	Epson Perfection V850	径向运动检测可选设备。本方案假设分辨率为300 dpi，大多数扫描仪均可适用
NGM（线虫生长培养基）	VWR	76347-412	用于培养 C. elegans 的培养基。可自行配制，详见 WormBook：C. elegans 的维持
OP50 大肠杆菌	秀丽隐杆线虫遗传学中心 (CGC)	OP50	C. elegans 的主要食物来源
p1000 移液器	VWR	76207-552	移液器，用于游泳检测
p1000 吸头	VWR	83007-384	移液器吸头，用于游泳检测
铂丝，直径 0.2032 mm	VWR	BT136585-5M	细规格铂丝，用于制作线虫挑针——一手持玻璃吸管，另一手持镊子夹住约1"长的铂丝，在火焰上加热连接
直尺	VWR	56510-001	用于评分径向运动检测结果
ImageJ	NIH	-	NIH 提供的可选免费软件 — https://imagej.nih.gov/ij/
WormLab 成像系统	MBF Bioscience	WormLab	该成像系统包括 WormLab 硬件（明场 载物台、相机和外壳） 及 WormLab 软件。https:// www.mbfbioscience.com/wormlabimaging- system