使用寡核苷酸探针进行原位杂交研究大鼠脑切片中的RNA表达

摘要

来源：Shokry, I. M., 等. 快速 原位 使用寡核苷酸探针在甲醛固定的大鼠脑组织上进行杂交以检测5-羟色胺综合征 视频实验期刊 (2015).

本视频展示了利用寡核苷酸探针检测受5-羟色胺综合征影响的大鼠脑组织中5-羟色胺受体RNA合成的方法。该实验方案包括组织预处理、探针杂交以及酶促检测，以在显微镜下可视化并定量分析5-羟色胺受体RNA的表达水平。

方案

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 准备

1. 组织制备与切片
   1. 将大鼠随机分为三组：新鲜/生理盐水组（SAL；0.9% NaCl）、预固定/SAL组和预固定/3,4-亚甲二氧基甲基苯丙胺组（MDMA；详见表1）。
   2. 分别对SAL组和MDMA组大鼠腹腔注射1 ml/kg SAL和10 mg/kg MDMA，每2小时一次，共三次。让动物存活6天。
   3. 第7天，对大鼠腹腔注射100 mg/kg氯胺酮联合5 mg/kg赛拉嗪，以实现深度麻醉（即角膜眨眼反射和尾夹反射消失）。
   4. 对于新鲜/SAL组，迅速断头处死大鼠并取出脑组织用于新鲜脑检测。
   5. 对于预固定/SAL组和预固定/MDMA组，沿胸骨做一长约10–12 cm的切口，暴露胸骨末端。
   6. 用止血钳夹住胸骨末端，用锐利剪刀在两侧横向剪开膈肌，然后沿肋骨向上剪开并与肺平行。
   7. 一只手用小镊子夹住心脏腹侧尖端，另一只手用18 G注射器针头穿刺左心室（注意针头的接头端通过Y形硅胶管连接至冰浴中的SAL和多聚甲醛容器及蠕动泵）。
   8. 将SAL泵调至中等流速（约5 ml/min）启动，用镊子穿刺右心房以允许回流液体排出。维持SAL灌注30分钟。

结果

表1. 实验设计

	新鲜	多聚甲醛预固定的a
	SALb	SALb	MDMAc
靶标探针 (htr2a)	√	√	√
阳性探针 (ppiB)	–	√	√
.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RNAscope 阴性对照探针-DapB	Advanced cell diagnostic, INC	310098
RNAscope 预处理试剂 4	Advanced cell diagnostic, INC	320046
RNAscope 2.0 HD 试剂盒 - 红色	Advanced cell diagnostic, INC	310036
RNAscope 探针 - Rn-Ppib	Advanced cell diagnostic, INC	313921
大鼠 Htr2a	Advanced cell diagnostic, INC	300031
冷冻切片机	Leica	CM 1850
水平摇床	VWR	88032-088
杂交炉	Thermo Fisher Scientific	222000
Superfrost Plus 显微镜载玻片	Fisher Scientific	12-550-15
疏水笔	Vector	H-4000
显微镜	Olympus	Provis AX70