使用寡核苷酸探针进行原位杂交研究大鼠脑切片中的RNA表达

摘要

来源：Shokry, I. M., 等. 快速 原位 使用寡核苷酸探针在甲醛固定的大鼠脑组织上进行杂交以检测5-羟色胺综合征 视频实验期刊 (2015).

本视频展示了利用寡核苷酸探针检测受5-羟色胺综合征影响的大鼠脑组织中5-羟色胺受体RNA合成的方法。该实验方案包括组织预处理、探针杂交以及酶促检测，以在显微镜下可视化并定量分析5-羟色胺受体RNA的表达水平。

方案

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 准备

1. 组织制备与切片
   1. 将大鼠随机分为三组：新鲜/生理盐水组（SAL；0.9% NaCl）、预固定/SAL组和预固定/3,4-亚甲二氧基甲基苯丙胺组（MDMA；详见表1）。
   2. 分别对SAL组和MDMA组大鼠腹腔注射1 ml/kg SAL和10 mg/kg MDMA，每2小时一次，共三次。让动物存活6天。
   3. 第7天，对大鼠腹腔注射100 mg/kg氯胺酮联合5 mg/kg赛拉嗪，以实现深度麻醉（即角膜眨眼反射和尾夹反射消失）。
   4. 对于新鲜/SAL组，迅速断头处死大鼠并取出脑组织用于新鲜脑检测。
   5. 对于预固定/SAL组和预固定/MDMA组，沿胸骨做一长约10–12 cm的切口，暴露胸骨末端。
   6. 用止血钳夹住胸骨末端，用锐利剪刀在两侧横向剪开膈肌，然后沿肋骨向上剪开并与肺平行。
   7. 一只手用小镊子夹住心脏腹侧尖端，另一只手用18 G注射器针头穿刺左心室（注意针头的接头端通过Y形硅胶管连接至冰浴中的SAL和多聚甲醛容器及蠕动泵）。
   8. 将SAL泵调至中等流速（约5 ml/min）启动，用镊子穿刺右心房以允许回流液体排出。维持SAL灌注30分钟。
   9. 将多聚甲醛泵调至中等流速启动，使冰浴的4%多聚甲醛灌注动物30分钟。
   10. 移除灌注装置并断头处死动物。沿颅骨中线做前后方向切口，掀开颅骨以暴露颅腔。
   11. 用刮匙从颅腔中取出脑组织，放入含有25 ml 4%多聚甲醛的50 ml离心管中。将含脑组织的离心管置于4 ºC冰箱中固定24小时。
   12. 将脑组织转移至另一含有25 ml 30%蔗糖溶液的50 ml离心管中，于4 ºC保存3天。最后将脑组织置于塑料袋中于-80 °C保存备用。
   13. 将脑组织用包埋介质固定于持样头，在-26 ºC恒温冷冻切片机中冷冻。将新鲜冷冻脑组织切成20 µm切片，将多聚甲醛预固定的脑组织切成10 µm切片。通过轻轻接触切片的方式将其转移至室温（RT）载玻片上。
   14. 室温下空气干燥4小时。将切片载玻片密封于密闭袋中，于-80 °C保存备用。
2. 脱水
   1. 从-80 °C冰箱中取出载玻片，将切片分配至以下三种检测之一：5-羟色胺5-HT_2A受体基因（ht2a）、ppiB（肽基脯氨酰异构酶B基因，阳性对照）或dapB（细菌二氢二羟基吡啶二羧酸还原酶基因，阴性对照）；用圆珠笔标记并标注切片（勿用铅笔）。将载玻片浸入100%乙醇中，室温下5分钟。在通风橱中干燥5分钟。
3. 预处理
   1. 向载玻片上的切片滴加20 µl预处理试剂1（碱性磷酸酶失活剂）。将载玻片置于湿润盒内的支架轨道上（注意：湿润盒需加盖以维持高湿度，防止反应液蒸发）。
   2. 将湿润盒置于水平摇床上，低速轻柔振荡10分钟。用双蒸水（ddH₂O）洗涤载玻片两次，每次2分钟。将载玻片浸入盛有150 ml预处理试剂2（断裂多聚甲醛固定引起的交联结构）的200 ml烧杯中。在100 ºC下煮沸共5分钟（热诱导恢复RNA结构）。
   3. 用双蒸水（ddH₂O）洗涤载玻片两次，每次2分钟。将载玻片浸入100%乙醇中5分钟。在通风橱中干燥5分钟。使用疏水性笔在组织切片选定区域周围画圈（例如，非皮质结构，包括丘脑和下丘脑，如图1所示）。
   4. 向每个选定区域滴加10 µl预处理试剂3（增强探针渗透性），并盖上湿润盒盖子。将湿润盒放入配备水平摇床的杂交炉中，设定炉温为40 ºC，轻柔振荡30分钟。用双蒸水（ddH₂O）洗涤载玻片两次，每次2分钟。

2. 杂交与扩增

1. 分别吸取10 µl的htr2a、ppiB和dapB探针试剂至选定区域。用盖子盖好保湿盒以防止试剂蒸发，在低速设置的水平摇床上轻轻振荡。将玻片置于40 ºC的烘箱中孵育2小时。
2. 用洗涤缓冲液洗涤玻片两次，每次2分钟。在每个选定区域加入10 µl扩增试剂1，振荡后于40 ºC孵育30分钟。
3. 用洗涤缓冲液洗涤玻片两次，每次2分钟。在每个选定区域加入10 µl扩增试剂2，振荡后于40 ºC孵育15分钟。
4. 用洗涤缓冲液洗涤玻片两次，每次2分钟。在每个选定区域加入10 µl扩增试剂3，振荡后于40 ºC孵育30分钟。
5. 用洗涤缓冲液洗涤玻片两次，每次2分钟。在每个选定区域加入10 µl扩增试剂4，振荡后于40 ºC孵育15分钟。
6. 用洗涤缓冲液洗涤玻片两次，每次2分钟。在每个选定区域加入10 µl扩增试剂5，振荡后于室温（RT）孵育30分钟。
7. 用洗涤缓冲液洗涤玻片两次，每次2分钟。在每个选定区域加入10 µl扩增试剂6，振荡后于室温（RT）孵育15分钟。再用洗涤缓冲液洗涤玻片两次，每次2分钟。

3. 信号检测

1. 用移液器向每个选定区域加入 10 µl 红色试剂（注意：该试剂为 Red-B 与 Red-A 按 1:60 比例混合而成，应立即使用）。将载玻片放入水平摇床上的湿盒中，室温下低速轻轻振荡 10 分钟。
2. 用 (ddH₂O) 洗涤载玻片两次，每次 10 分钟。将载玻片置于烘箱中 60 ºC 干燥 15 分钟。将载玻片置于通风橱内的二甲苯中 5 分钟。向每个选定区域滴加 20 µl 二甲苯基封片介质，并加盖盖玻片。

结果

表1. 实验设计

	新鲜	多聚甲醛预固定的a
	SALb	SALb	MDMAc
靶标探针 (htr2a)	√	√	√
阳性探针 (ppiB)	–	√	√
...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RNAscope 阴性对照探针-DapB	Advanced cell diagnostic, INC	310098
RNAscope 预处理试剂 4	Advanced cell diagnostic, INC	320046
RNAscope 2.0 HD 试剂盒 - 红色	Advanced cell diagnostic, INC	310036
RNAscope 探针 - Rn-Ppib	Advanced cell diagnostic, INC	313921
大鼠 Htr2a	Advanced cell diagnostic, INC	300031
冷冻切片机	Leica	CM 1850
水平摇床	VWR	88032-088
杂交炉	Thermo Fisher Scientific	222000
Superfrost Plus 显微镜载玻片	Fisher Scientific	12-550-15
疏水笔	Vector	H-4000
显微镜	Olympus	Provis AX70