小鼠脑片中小脑浦肯野神经元长时程抑制的诱导

摘要

来源：Yamaguchi, K.，等。成年小脑切片中长时程抑制诱导的评估。J. Vis. Exp. (2019)

在本视频中，采用小鼠小脑脑片研究了平行纤维、攀爬纤维与浦肯野细胞之间的突触相互作用，这些相互作用对运动控制至关重要。攀爬纤维的刺激在浦肯野细胞中诱导出长时程抑制（LTD），削弱了突触强度，导致对平行纤维刺激的反应减弱。

方案

所有涉及动物样本的实验程序均已通过相应的动物伦理审查委员会的审核与批准。

1. 脑切片

1. 将样品调整至小脑背侧朝前的位置。倒入足够浸没小脑的冰冷切割型人工脑脊液（ACSF，Artificial cerebrospinal fluid），其中含 1 µM 河豚毒素（TTX, Tetrodotoxin）。将通气管插入 ACSF 中，并用 O₂/CO₂ 混合气体持续通气。
2. 在双目显微镜下用精细镊子去除蛛网膜。用刀片切断小脑脚，移除脑干和琼脂块。将切片槽旋转 180°，使小脑背侧面向剃刀刀片。
3. 安装刀片并调整首次切割位置。设置振动切片机的参数如下：振幅 5.5，频率 85 Hz，速度 3–4，切片厚度 300 µm。
4. 将小脑切片转移至尼龙网上，放入丙烯酸孵育槽中，并完全浸入充氧的 ACSF 中。孵育槽应置于水浴中，维持温度为 26 °C。
5. 将切片至少储存 1 小时，以使其从切片过程中的损伤中恢复。

2. 全细胞膜片钳记录

注意：膜片钳记录需要以下设备：配备红外微分干涉差（IR-DIC）光学系统的直立显微镜、膜片钳放大器....

结果

图 1：诱导浦肯野细胞-平行纤维突触长时程抑制（LTD）的实验方案示意图。（A）方案 1：在电流钳条件下，同时施加 1 次平行纤维（PF）刺激和 1 次攀爬纤维（CF）刺激，以 1 Hz 的频率重复 300 次（持续 5 分钟）。全细胞记录电极内充以基于 K⁺ 的内液。（B）方案 2：在电流钳条件下，同时施加 2 次平行纤维（PF）刺激和 1 次攀爬纤维（CF）刺激，以 1 Hz 的频率重复 300 次（持续 5 分钟）。电极内充以基于 K⁺ 的内液。（C）方案 3：在电压钳条件下，施加 2 次平行纤维（PF）刺激与胞.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
放大器	Molecular Devices-Axon	Multiclamp 700B
硼硅酸盐玻璃毛细管	Sutter	BF150-110-10
数字转换器	Molecular Devices-Axon	Digidata1322A
电极拉制仪	Sutter	Model P-97
异氟烷	FUJIFILM Wako Pure Chemical	26675-46-7
隔离器	A.M.P.I.	ISOflex
线性切片机	Dosaka EM	PRO7N
显微镜	NIKON	Eclipse E600FN
蠕动泵	Gilson	MP1 Single Channel Pump
苦味毒	Sigma-Aldrich	P1675
纯水制备仪	Merck-Millipore	MilliQ 7000
实验软件	Molecular probe-Axon	pClamp 10
统计软件	KyensLab	KyPlot 5.0
刺激器	WPI	DS8000
温度控制器	Warner	TC-324B
河豚毒素	Tocris	1078