小鼠脑片中小脑浦肯野神经元长时程抑制的诱导

摘要

来源：Yamaguchi, K.，等。成年小脑切片中长时程抑制诱导的评估。J. Vis. Exp. (2019)

在本视频中，采用小鼠小脑脑片研究了平行纤维、攀爬纤维与浦肯野细胞之间的突触相互作用，这些相互作用对运动控制至关重要。攀爬纤维的刺激在浦肯野细胞中诱导出长时程抑制（LTD），削弱了突触强度，导致对平行纤维刺激的反应减弱。

方案

所有涉及动物样本的实验程序均已通过相应的动物伦理审查委员会的审核与批准。

1. 脑切片

1. 将样品调整至小脑背侧朝前的位置。倒入足够浸没小脑的冰冷切割型人工脑脊液（ACSF，Artificial cerebrospinal fluid），其中含 1 µM 河豚毒素（TTX, Tetrodotoxin）。将通气管插入 ACSF 中，并用 O₂/CO₂ 混合气体持续通气。
2. 在双目显微镜下用精细镊子去除蛛网膜。用刀片切断小脑脚，移除脑干和琼脂块。将切片槽旋转 180°，使小脑背侧面向剃刀刀片。
3. 安装刀片并调整首次切割位置。设置振动切片机的参数如下：振幅 5.5，频率 85 Hz，速度 3–4，切片厚度 300 µm。
4. 将小脑切片转移至尼龙网上，放入丙烯酸孵育槽中，并完全浸入充氧的 ACSF 中。孵育槽应置于水浴中，维持温度为 26 °C。
5. 将切片至少储存 1 小时，以使其从切片过程中的损伤中恢复。

2. 全细胞膜片钳记录

注意：膜片钳记录需要以下设备：配备红外微分干涉差（IR-DIC）光学系统的直立显微镜、膜片钳放大器、数据采样器、数字刺激器、隔离器、计算机、用于数据采集和分析的软件、电动操纵器、显微镜平台、防震台、法拉第笼、溶液加热系统、蠕动泵和电极拉制仪。

1. 向 ACSF 中加入苦味毒（0.1 mM），并使用超声处理溶解 3 分钟。
2. 以含苦味毒且经 O₂-CO₂ 饱和的 ACSF 以 2 mL/min 的流速灌注记录室。将记录室的温度维持在约 30 °C。
3. 使用拉制仪四步拉制带细丝的硼硅酸盐玻璃毛细管（外径 = 1.5 mm）制备记录电极。尖端直径应约为 1 µm。
4. 使用拉制仪两步拉制相同的毛细管制备刺激电极，然后在双目显微镜下轻敲其尖端撞击铁块以形成细尖。最终直径应为 3–5 µm。
5. 将小脑切片转移至记录室，并用带尼龙线的铂金丝网固定。用 ACSF 充填刺激电极。
6. 为刺激平行纤维（PFs），将刺激电极置于分子层表面，距离浦肯野细胞层约 50 µm 处。
7. 为刺激攀爬纤维（CF），将刺激电极置于浦肯野细胞层底部（步骤 3.3、3.4）。
8. 用 0.45 µm 滤器过滤含 K⁺ 或 Cs⁺ 的胞内液。使用微量加样器向记录电极中加入 8 µL 胞内液。
9. 在将记录电极浸入 ACSF 前，施加微弱正压。电极电阻应为 2–4 MΩ，并校正液接电位。
10. 用记录电极接近健康、明亮的浦肯野细胞（PC）胞体。轻微推动浦肯野细胞表面，停止施加正压，随后施加负压直至形成吉欧姆封接，再通过负压建立全细胞记录模式。
11. 将膜电位钳制在 -70 mV，并以 0.1 Hz 频率施加 -2 mV 脉冲（持续时间 100 ms），连续监测输入电阻、串联电阻和输入电容。不使用串联电阻补偿。当串联电阻变化超过 15% 时，舍弃该数据。

3. LTD（长时程抑制）的诱导

1. 使用脉冲（持续时间 0.1 ms）刺激分子层。通过施加双脉冲刺激（脉冲间间隔（ISI）为 50 ms）来鉴定平行纤维（PF）兴奋性突触后电流（EPSC）。随着刺激强度的增加，PF-EPSC 应表现出成对脉冲易化作用以及振幅的逐渐增大。
2. 以 0.1 Hz 的频率施加单脉冲，记录 PF-EPSC 的测试反应。调节刺激强度，使诱发出的 EPSC 振幅约为 200 pA。避免电压依赖性离子通道引起的电流污染。
3. 在浦肯野细胞层底部刺激攀爬纤维（CF），并通过施加双脉冲刺激来鉴定由 CF 激活引发的 EPSC。随着刺激强度的增加，CF-EPSC 应表现出成对脉冲抑制作用，并呈现“全或无”的特性。为诱导长时程抑制（LTD），应使用单次刺激。
4. LTD诱导方案1​
   1. 在电流钳条件下，使用含 K⁺ 基内液的电极，以 1 Hz 频率同时施加单次 PF 刺激和单次 CF 刺激，持续 5 分钟（共 300 次脉冲）（图1A）。
5. LTD诱导方案2
   1. 在电流钳条件下，使用含 K⁺ 基内液的电极，以 1 Hz 频率施加双 PF 刺激（ISI 为 50 ms）和单 CF 刺激，使第二次 PF 刺激与 CF 刺激同步，持续 5 分钟（图1B）。
6. LTD诱导方案3
   1. 在电压钳条件下，使用含 Cs⁺ 基内液的电极，以 1 Hz 频率施加双 PF 刺激（ISI 为 50 ms）和单次去极化电压阶跃（-70 至 0 mV，持续 50 ms）于胞体，持续 3 分钟，使第二次 PF 刺激与去极化电压阶跃的起始时间一致（图1C）。
7. LTD诱导方案4​
   1. 在电压钳条件下，使用含 Cs⁺ 基内液的电极，以 0.5 Hz 频率同时施加 PF 刺激（100 Hz 下 5 次）和单次去极化电压阶跃（-70 至 0 mV，持续 50 ms）于胞体，持续 3 分钟（图1D）。

结果

图 1：诱导浦肯野细胞-平行纤维突触长时程抑制（LTD）的实验方案示意图。（A）方案 1：在电流钳条件下，同时施加 1 次平行纤维（PF）刺激和 1 次攀爬纤维（CF）刺激，以 1 Hz 的频率重复 300 次（持续 5 分钟）。全细胞记录电极内充以基于 K⁺ 的内液。（B）方案 2：在电流钳条件下，同时施加 2 次平行纤维（PF）刺激和 1 次攀爬纤维（CF）刺激，以 1 Hz 的频率重复 300 次（持续 5 分钟）。电极内充以基于 K⁺ 的内液。（C）方案 3：在电压钳条件下，施加 2 次平行纤维（PF）刺激与胞...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
放大器	Molecular Devices-Axon	Multiclamp 700B
硼硅酸盐玻璃毛细管	Sutter	BF150-110-10
数字转换器	Molecular Devices-Axon	Digidata1322A
电极拉制仪	Sutter	Model P-97
异氟烷	FUJIFILM Wako Pure Chemical	26675-46-7
隔离器	A.M.P.I.	ISOflex
线性切片机	Dosaka EM	PRO7N
显微镜	NIKON	Eclipse E600FN
蠕动泵	Gilson	MP1 Single Channel Pump
苦味毒	Sigma-Aldrich	P1675
纯水制备仪	Merck-Millipore	MilliQ 7000
实验软件	Molecular probe-Axon	pClamp 10
统计软件	KyensLab	KyPlot 5.0
刺激器	WPI	DS8000
温度控制器	Warner	TC-324B
河豚毒素	Tocris	1078