一个 体外 研究病原体穿越血脑屏障及脑细胞感染的模型

摘要

来源：da Costa, A.，等。一种用于研究病原体或药物穿越血脑屏障及其与大脑相互作用的人源性血脑界面模型。J. Vis. Exp. (2019)。

本视频展示了一种用于研究病原体穿越血脑屏障（BBB）的体外模型。表达紧密连接的微血管内皮细胞在上室形成内皮层，而神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞则在下室代表脑实质，两者之间由多孔膜隔开。在该BBB模型中进行病毒感染，可模拟病原体从血液进入脑组织的过程。当引入嗜神经病毒后，病毒通过转胞吞作用穿越血脑屏障，感染神经细胞，进行复制并释放子代病毒，从而展示出成功的神经侵入过程。

方案

1. 脑-血屏障-微型脑（BBB-Minibrain，Blood-brain barrier - Minibrain）的构建与质量控制（图1）

1. 建立血脑屏障-微型脑聚酯膜培养插入装置图1B)
   1. 将人脑微血管内皮细胞系（hCMEC/D3细胞）接种于12孔聚酯膜培养插件滤膜上，在内皮细胞培养基中培养6天，之后用于实验。
   2. 用多聚-D-赖氨酸（1 mL/孔，10 µg/mL，室温孵育4 h）包被12孔板，然后用层粘连蛋白（1 mL/孔，1 µg/mL，室温过夜）包被。
   3. 去除层粘连蛋白，加入1 mL添加了5%胎牛血清（FBS）的内皮细胞培养基（5%内皮细胞培养基）。
   4. 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 1 小时₂ 和95%湿度。
   5. 轻柔地用胰蛋白酶处理终末分化的人类神经元（hNeurons）和人类星形胶质细胞（hAstrocytes）（NT2-N/A）以及人类小胶质细胞系（CHME/Cl5），并用完全内皮细胞培养基重悬细胞沉淀。
   6. 计数细胞，混匀 3.6 x 10⁵ NT2-N/A 和 0.4 × 10⁵ CHME/Cl5 细胞/孔，接种至 12 孔板。
   7. 在T=24 h（接种后24 h）：更换为新鲜的完全内皮细胞培养基（MiniBrain细胞和内皮细胞），并将hCMEC/D3聚酯膜培养插件滤膜转移至MiniBrain细胞上方。将BBB-MiniBrain置于37 °C、5% CO₂条件下培养₂ 和95%湿度。
      注意： BBB-微型脑模型将由滤膜上的一层人源内皮细胞hCMEC/D3组成，该滤膜分隔了管腔室（即“血液”室）和微孔板底部由人源细胞hNT2-N/A与hCHME/Cl5（微型脑）混合培养构成的非管腔室（即“脑”室）。图 1B).
2. 血脑屏障迷你脑内皮通透性的验证（质量控制） （图1C）
   1. 制备转运缓冲液（TB），即含有 Ca 的 HBSS（Hanks 平衡盐溶液）缓冲液²⁺ 和 Mg²⁺ 添加10 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）和1 mM 丙酮酸钠。
   2. 每孔加入 1.5 mL 运输缓冲液，准备 12 孔板。
   3. 在 T=0 时，配制新鲜的运输缓冲液，并添加 50 µM 萤光黄（LY-TB）。
   4. 将每个滤膜倒置，小心移除培养基，避免影响内皮细胞屏障。
   5. 将滤膜置于已加满液体的12孔板上，加入0.5 mL LY-TB。
   6. 将培养板置于37°C、5% CO₂培养箱中孵育₂ 和95%湿度。
   7. 在 T=10 分钟时，将滤膜转移至新的含 TB 的 12 孔板中，并保留第一块板的基底侧室用于 OD 读数。
   8. 在 T = 25 分钟时，重复步骤 1.2.7。
   9. 在 T = 45 min 时，通过将滤膜从培养板中取出以终止转运过程。保留基底外侧和管腔侧组分用于 OD 测定。
   10. 将样品转移至避光的96孔板中：对于LY-TB和管腔室，取10 µL样品加入190 µL TB；对于血管外腔室，加入200 µL样品。
   11. 在不同样品中测定LY-TB的荧光，激发波长和发射波长分别为λ428 nm和λ535 nm。
   12. 计算内皮细胞对LY-TB的通透性（Pe）_LY）通过使用公式：
       1/PSe = (1/PSt) – (1/PSf) 和 Pe_LYPSe/S.
       注意： PSf 是无细胞滤膜的通透性，PSt 是有细胞滤膜的通透性，PSe 是内皮单层的通透性乘以单层的表面积，S 是单层的表面积（对于 12 孔滤膜 = 1.12 cm²）²），Pe_LY 以 cm/min 表示。对于 hCMEC/D3，Pe_LY 应在 0.7 到 1.2 x 10 之间^-3 cm/min，主要取决于实验中使用的FBS。重要提示：一个Pe_LY 高于1.2表示血脑屏障不够紧密，可观察到一定程度的渗漏，应弃用这些屏障。

2. 使用BBB-微型脑模型揭示黄热病疫苗样本中存在神经侵袭性病毒颗粒，即法国神经嗜性病毒YFV-FNV 34（图2）

1. 黄热病毒穿过血脑屏障并在迷你脑中复制
   1. 使用按步骤1.1.7所述方法制备的血脑屏障-迷你脑模型，在加病毒前24小时更换培养基为含2%胎牛血清（FBS）的内皮细胞培养基。
      注意：在添加病毒前避免更换培养基极为重要。更换培养基可能激活人源内皮细胞，导致屏障暂时开放，从而使病毒通过。本实验中，培养基在实验开始前24小时即已完成更换。
   2. 在T=0时，将3500个噬斑形成单位（PFU）的YFV-FNV病毒用50 µL含2% FBS的内皮细胞培养基稀释后，小心加入管腔侧 compartment 的顶部。对照组血脑屏障-迷你脑模型则加入50 µL不含病毒的含2% FBS内皮细胞培养基。同时在平行孔中测定Pe_LY值。
   3. 将血脑屏障-迷你脑模型置于37 °C、5% CO₂、95%湿度的培养箱中孵育。
   4. 24小时后，移除聚酯膜培养插件过滤装置，测定Pe_LY值，从基底外侧 compartment 取出1 mL培养基样品进行病毒滴度测定，并更换为新鲜的含2% FBS内皮细胞培养基。
   5. 继续将血脑屏障-迷你脑模型置于37 °C、5% CO₂、95%湿度条件下孵育。
   6. 72小时后，采集基底外侧 compartment 的培养基样品进行病毒滴度测定，和/或提取迷你脑细胞中的RNA用于基因表达分析。

结果

图1：血脑屏障-微型脑模型。A. hCMEC/D3细胞培养的时间安排及血脑屏障-微型脑装置照片：用镊子夹持含hCMEC/D3内皮屏障的聚酯膜培养插件滤膜，准备插入12孔细胞培养板的一个孔中。 B. 装置示意图，显示管腔侧（血液）区室包含内皮细胞屏障，以及管腔外侧（脑）区室包含微型脑细胞（人神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞）。 C. 通过跨内皮电阻（TEER）在三个装置上或荧光黄渗透性（PeLY）在五个滤膜上测定的血脑屏障-微型脑通透性的代表性数据。 D. 采用定量反转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）对hCMEC/D3内皮细胞上的受体、外排转...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
12 孔板	Corning	3336
85 mm 培养皿	Sarstedt	83-3902-500
CHME/Cl5	Unité de Neuroimmunologie Virale	向 Lafon 博士申请获取
CMC	Calbiochem	217274
黑色 96 孔板	Corning	3915
DMEM F12	Thermofisher Scientific	31330-038
DMSO	Merck-Sigma Aldrich	D2650
Endogro IV	Millipore	SCME004
乙醇	Carlo Erba	529121
FBS	Hyclone	SV30015-04	内皮细胞培养基
含 Ca2+-Mg2+ 的 HBSS	Thermofisher Scientific	14025-100
hCMEC/D3	Cedarlane	CLU512
Hepes 1 M	Thermofisher Scientific	15630-070
层粘连蛋白	Merck-Sigma Aldrich	L6274
L-谷氨酰胺	Thermofisher Scientific	25030-024
荧光黄	Merck-Sigma Aldrich	L0259
MEM 10X	Thermofisher Scientific	21430
MEM 1X	Thermofisher Scientific	42360
Ntera/Cl2D.1	ATCC	CRL-1973
多聚甲醛	Electron Microscopy Sciences	15714
不含 Ca2+-Mg2+ 的 PBS	Thermofisher Scientific	14190
PBS-Ca2+-Mg2+	Thermofisher Scientific	14040-091
青霉素-链霉素	Eurobio	CXXPES00-07
聚-D-赖氨酸	Merck-Sigma Aldrich	P1149
Prolong Gold	Thermofisher Scientific	P36930
RNA 纯化试剂盒	QIAGEN	74104
5.6% 碳酸氢钠	Eurobio	CXXBIC00-07
丙酮酸钠	Thermofisher Scientific	11360
T75 Cell+ 培养瓶	Sarstedt	83-1813-302	经特殊表面处理（Cell+）的组织培养级聚苯乙烯培养瓶，适用于敏感贴壁细胞
Transwell	Corning	3460	聚酯多孔膜细胞培养小室
胰蛋白酶-EDTA	Merck-Sigma Aldrich	T3924
超纯水	Thermofisher Scientific	10977-035
Versene	Thermofisher Scientific	15040-033	EDTA
YFV-FNV	IP Dakar	疫苗瓶