一个 体外 研究病原体穿越血脑屏障及脑细胞感染的模型

摘要

来源：da Costa, A.，等。一种用于研究病原体或药物穿越血脑屏障及其与大脑相互作用的人源性血脑界面模型。J. Vis. Exp. (2019)。

本视频展示了一种用于研究病原体穿越血脑屏障（BBB）的体外模型。表达紧密连接的微血管内皮细胞在上室形成内皮层，而神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞则在下室代表脑实质，两者之间由多孔膜隔开。在该BBB模型中进行病毒感染，可模拟病原体从血液进入脑组织的过程。当引入嗜神经病毒后，病毒通过转胞吞作用穿越血脑屏障，感染神经细胞，进行复制并释放子代病毒，从而展示出成功的神经侵入过程。

方案

1. 脑-血屏障-微型脑（BBB-Minibrain，Blood-brain barrier - Minibrain）的构建与质量控制（图1）

1. 建立血脑屏障-微型脑聚酯膜培养插入装置图1B)
   1. 将人脑微血管内皮细胞系（hCMEC/D3细胞）接种于12孔聚酯膜培养插件滤膜上，在内皮细胞培养基中培养6天，之后用于实验。
   2. 用多聚-D-赖氨酸（1 mL/孔，10 µg/mL，室温孵育4 h）包被12孔板，然后用层粘连蛋白（1 mL/孔，1 µg/mL，室温过夜）包被。
   3. 去除层粘连蛋白，加入1 mL添加了5%胎牛血清（FBS）的内皮细胞培养基（5%内皮细胞培养基）。
   4. 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 1 小时₂ 和95%湿度。
   5. 轻柔地用胰蛋白酶处理终末分化的人类神经元（hNeurons）和人类星形胶质细胞（hAstrocytes）（NT2-N/A）以及人类小胶质细胞系（CHME/Cl5），并用完全内皮细胞培养基重悬细胞沉淀。
   6. 计数细胞，混匀 3.6 x 10⁵ NT2-N/A 和 0.4 × 10⁵ CHME/Cl5 细胞/孔，接种至 12 孔板。
   7. 在T=24 h（接种后24 h）：更换为新鲜的完全内皮细胞培养基（MiniBrai....

结果

图1：血脑屏障-微型脑模型。A. hCMEC/D3细胞培养的时间安排及血脑屏障-微型脑装置照片：用镊子夹持含hCMEC/D3内皮屏障的聚酯膜培养插件滤膜，准备插入12孔细胞培养板的一个孔中。 B. 装置示意图，显示管腔侧（血液）区室包含内皮细胞屏障，以及管腔外侧（脑）区室包含微型脑细胞（人神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞）。 C. 通过跨内皮电阻（TEER）在三个装置上或荧光黄渗透性（PeLY）在五个滤膜上测定的血脑屏障-微型脑通透性的代表性数据。 D. 采用定量反转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）对hCMEC/D3内皮细胞上的受体、外排转.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
12 孔板	Corning	3336
85 mm 培养皿	Sarstedt	83-3902-500
CHME/Cl5	Unité de Neuroimmunologie Virale	向 Lafon 博士申请获取
CMC	Calbiochem	217274
黑色 96 孔板	Corning	3915
DMEM F12	Thermofisher Scientific	31330-038
DMSO	Merck-Sigma Aldrich	D2650
Endogro IV	Millipore	SCME004
乙醇	Carlo Erba	529121
FBS	Hyclone	SV30015-04	内皮细胞培养基
含 Ca2+-Mg2+ 的 HBSS	Thermofisher Scientific	14025-100
hCMEC/D3	Cedarlane	CLU512
Hepes 1 M	Thermofisher Scientific	15630-070
层粘连蛋白	Merck-Sigma Aldrich	L6274
L-谷氨酰胺	Thermofisher Scientific	25030-024
荧光黄	Merck-Sigma Aldrich	L0259
MEM 10X	Thermofisher Scientific	21430
MEM 1X	Thermofisher Scientific	42360
Ntera/Cl2D.1	ATCC	CRL-1973
多聚甲醛	Electron Microscopy Sciences	15714
不含 Ca2+-Mg2+ 的 PBS	Thermofisher Scientific	14190
PBS-Ca2+-Mg2+	Thermofisher Scientific	14040-091
青霉素-链霉素	Eurobio	CXXPES00-07
聚-D-赖氨酸	Merck-Sigma Aldrich	P1149
Prolong Gold	Thermofisher Scientific	P36930
RNA 纯化试剂盒	QIAGEN	74104
5.6% 碳酸氢钠	Eurobio	CXXBIC00-07
丙酮酸钠	Thermofisher Scientific	11360
T75 Cell+ 培养瓶	Sarstedt	83-1813-302	经特殊表面处理（Cell+）的组织培养级聚苯乙烯培养瓶，适用于敏感贴壁细胞
Transwell	Corning	3460	聚酯多孔膜细胞培养小室
胰蛋白酶-EDTA	Merck-Sigma Aldrich	T3924
超纯水	Thermofisher Scientific	10977-035
Versene	Thermofisher Scientific	15040-033	EDTA
YFV-FNV	IP Dakar	疫苗瓶