果蝇大脑的免疫荧光染色用于胶质细胞的单细胞成像

摘要

来源：Batelli, S., 等. 多色 FlpOut 技术在研究胶质细胞高分辨率单细胞形态及细胞间相互作用中的应用 果蝇. 视频实验杂志 (2017).

本视频展示了对转基因果蝇大脑进行免疫荧光染色，以实现胶质细胞的单细胞成像。该果蝇大脑在胶质细胞特异性重组酶系统的调控下，表达与不同抗原表位组合融合的膜靶向蛋白。分离并固定的脑组织经针对这些抗原表位的一抗孵育后，再使用荧光染料偶联的二抗进行染色。该标记方法可实现对不同脑区中多种胶质细胞亚群的同时成像。

方案

1. 多色 FlpOut（MCFO）实验的果蝇准备

注意：MCFO 技术指的是所谓的 Flp 介导的终止盒切除（FlpOut）方法的一种改良版本。转基因 MCFO 果蝇携带一个热激启动子（hsp）驱动的 Flp 重组酶，以及在上游激活序列（UAS）控制下的不同报告基因。每个报告基因均由一个共同的骨架组成，即肉豆蔻酰化（myr）超折叠绿色荧光蛋白（sfGFP），其中插入了 10 个拷贝的表位标签（例如，HA、FLAG 或 V5）。由此产生的非荧光蛋白被称为“意大利面怪物 GFP”（smGFP），可通过针对不同表位标签的特异性抗体进行检测。

1. 将带有 MCFO 盒式元件和 hsp-Flp 的果蝇（hsp-Flp; 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA,10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5）与适当的胶质细胞 GAL4 驱动品系杂交（见材料表）。
   1. 由于 hsp 在 25 °C 时已具有活性，可能导致少数细胞发生重组，从而引起非特异性标记，因此为避免系统渗漏，应在 18 °C 下设置杂交。在 18 °C 下培养约 20 天以获得 F1 代。热激后（见步骤 2），将果蝇维持在 25 °C（图 1）。

2. 热激

注意：根据插入位点的不同，hsp-Flp 的效率可能有所差异；因此，最适热激时间需要进行优化。本方案中使用了将 hsp-Flp 插入 X 染色体的 MCFO 果蝇品系（见材料表）。

1. 将步骤1.1中杂交所得子代（F1代果蝇，3-4日龄）转移至含有培养基的新试管中，并将试管置于37 °C水浴中进行热激处理。
   注意：年轻的果蝇（1-2日龄）对热激非常敏感。为降低处理引起的死亡率，建议等待1至2天后再进行热激。可保留部分F1代果蝇作为未热激的对照组。
2. 热激过程中，将果蝇保留在含有培养基的常规试管中，以减少应激导致的死亡率。雌雄果蝇应分别置于不同的试管中。
3. 确保整个试管完全浸入水中，以实现均匀的热激。对于使用多种GAL4驱动系实现胶质细胞稀疏标记的情况，可采用5-8分钟的热激时间作为合适的起始条件；但具体热激时长需根据不同的驱动系和实验进行优化（可能需要更短或更长的热激时间）。
4. 热激结束后，将试管水平放置于实验台数分钟，使果蝇有时间恢复。
   注意：无需更换试管。
5. 将果蝇继续在25 °C条件下培养，并在热激后2天或更长时间进行解剖（见步骤3和4），以获得最佳的报告基因表达效果。

3. 解剖准备与溶液配制

1. 解剖当天，将180 µL S2细胞培养基与20 µL 20%多聚甲醛（PFA）混合，于200 µL PCR管中配制新鲜固定液，得到2% PFA溶液。解剖前及解剖过程中，固定液需置于冰上保存。
   注意： PFA 具有毒性，必须小心操作。
   注意： 在200 µL聚合酶链式反应（PCR）管中，将160 µL S2细胞培养基与40 µL 20%多聚甲醛（PFA）混合，以配制4% PFA溶液，而非2%溶液。
2. 每种基因型使用一个PCR管，每管最多放入8-10个脑组织，以获得最佳染色效果。
3. 配制成年脑组织洗涤液：含0.5%牛血清白蛋白和0.5% Triton X-100的磷酸盐缓冲液（PBS）。
   注意：根据染色情况，可能需要含有1% Triton X-100的溶液。提高Triton X-100的浓度可增强抗体进入组织的穿透性，对于染色位于组织深部的区域是必要的例如， 成年个体中的突触区域 黑腹果蝇 脑
4. 配制封闭液：在PBS中加入3%正常山羊血清、3%正常驴血清和0.5% Triton X-100。
5. 成年脑灌注液和封闭液可在4 °C下保存数周。
6. 将深孔玻片置于冰上，然后向每个孔中加入以下溶液：一孔加入70%乙醇，一孔加入PBS，另一孔加入S2细胞培养基。

4. 成年小鼠脑组织解剖

1. 将一个直径为 3 cm 的解剖皿置于体视显微镜载物台上，并加入冷的 S2 细胞培养基。所有解剖操作均在此培养基中进行，以确保组织在解剖过程中保持健康。
   注意：建议使用内衬数毫米厚黑色硅胶的解剖皿，以提供良好的背景对比度（在图像中），并在解剖过程中妥善保存镊子。
2. 用 CO₂ 麻醉所需基因型的果蝇。
3. 用镊子夹住果蝇的翅膀，先在冷的 70% 乙醇中清洗 30 秒，再用冷的 PBS 清洗 30 秒。
4. 将果蝇转移至盛有 S2 细胞培养基的深孔解剖皿中。
5. 对同基因型的所有果蝇重复上述步骤，并将其保留在冷的 S2 细胞培养基中直至开始解剖，以维持组织活性。
   注意：仅麻醉约 30 分钟内可完成解剖的果蝇数量。在 S2 细胞培养基中长时间孵育可能损伤组织。
6. 用镊子夹住果蝇，在体视显微镜下将其完全浸入 S2 细胞培养基中。
7. 将头部与身体分离。弃去身体部分，保留头部浸没在 S2 细胞培养基中。在整个解剖过程中必须始终用镊子夹住头部。若头部开始上浮，则在不损伤组织的情况下重新捕获将变得困难。
8. 开始解剖时，在始终至少用一把镊子固定头部的同时，拉出一只眼睛。确保镊子尖端刚好位于视网膜下方，以避免损伤下方组织。随后拉出另一只眼睛，并逐步去除头壳，直至脑组织暴露。
9. 清除脑组织周围的所有气管组织和头壳，直至组织外观干净。为获得最佳染色效果，务必彻底清除脑周围的气管组织；此时组织已准备好进行固定和染色。
10. 在将所有解剖获得的脑组织转移至 PFA 溶液前，先将其保留在冷的 S2 细胞培养基中，以便精确控制固定步骤的时间。

5. 成年大脑染色

1. 使用 P10 移液器将分离的脑组织转移至室温（RT）下的 PFA 溶液中。为避免组织损伤，在解剖后切勿使用镊子转移脑组织。所有步骤均在 200 µL PCR 管中进行，并置于摇床上操作。
2. 所有步骤中，在使用 P200 移液器弃去旧溶液前，需先让脑组织沉降至管底。尽量移除上清液，避免吸入组织。操作过程中需避免组织暴露于光照下。
3. 使用含 2% PFA 的 S2 细胞培养基 200 µL 固定脑组织 1 小时，或使用 4% PFA 固定 30 分钟。为提高实验可重复性，各样本间的固定时间应保持一致。
4. 在 200 µL 成年果蝇脑清洗液中清洗 3 次（或更多次），每次 15 分钟，随后加入 200 µL 封闭液封闭 30 分钟。封闭时间可适当延长。
5. 将脑组织与一抗在 200 µL 成年果蝇脑清洗液中稀释后，于 4 °C 下孵育过夜。
   注意： 孵育时间可能因所用抗体类型而异，必要时可延长孵育时间。
   1. 为标记三种 MCFO 标记物，需使用抗 HA 抗体（1:500）、抗 FLAG（DYKDDDDK 表位）抗体（1:100）和抗 V5 一抗进行孵育。
   2. 可选用直接偶联荧光染料的一抗替代常规的一抗+二抗组合（例如，抗 V5:DyLight 549（1:200））。此时，将直接偶联抗体视为二抗处理。
      注意： 对每种基因型，应保留部分脑组织作为对照，以验证染色的特异性。跳过一抗孵育步骤，直接进入下一步。
6. 用 200 µL 成年果蝇脑清洗液清洗组织 3 次，每次 1 小时（步骤 3.3），随后在 200 µL 成年果蝇脑清洗液中加入稀释后的荧光标记二抗或直接偶联的一抗，于 4 °C 下孵育过夜，或在室温下孵育 4 小时，总体积为 200 µL。
   注意： 合适的抗体示例包括：AlexaFluor 488（1:250）、抗 V5:DyLight 549（1:200）以及 DyLight 647 偶联抗体（1:100）。
7. 用 200 µL 成年果蝇脑清洗液清洗脑组织 3 次，每次 1 小时，随后在 200 µL PBS 中于 4 °C 下过夜或室温下 1–2 小时进行最终清洗。PBS 的最终清洗步骤可彻底去除 Triton X-100 残留，对获得最佳染色效果至关重要。将脑组织置于含抗荧光淬灭剂的封片剂中，加盖玻片封片。

6. 脑组织成像用切片的制备

1. 使用剪刀将成像间隔片修剪至合适尺寸。对于高分辨率显微镜观察，将样本和成像间隔片夹在两张玻璃盖玻片之间。
   注意：成像间隔片是一种薄型（厚度0.12 mm）的粘性间隔材料，可剥离并粘附于玻璃盖玻片或显微镜载玻片表面，使样本在无压缩状态下固定。
2. 使用镊子去除一侧表面的粘性保护膜，并将间隔片有粘性的一面朝下贴附于一张玻璃盖玻片（22 mm × 60 mm）表面。在另一张新的玻璃盖玻片上加入10 µL封片介质。
3. 使用P10移液器将脑组织从200 µL离心管转移至盖玻片上，置于封片介质液滴旁。转移组织时需同时带入部分PBS，以保持脑组织处于溶液环境中。
4. 使用P10移液器将脑组织从PBS中转移至封片介质液滴中，尽量减少PBS的带入量。将样本置于含封片介质的盖玻片上，并使其位于成像间隔片范围内。加入足量封片介质以完全覆盖样本。
5. 去除间隔片上表面的另一层粘性保护膜，然后将玻璃盖玻片覆盖在样本上方。用镊子尖端轻轻按压粘合区域，确保密封。立即进行成像，或将载片储存于-20 °C环境中以备后续分析。

结果

图1：MCFO技术的杂交方案。 MCFO技术的示意图。将携带MCFO表达盒和hsp-Flp（hsp-Flp；10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA,10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5）的纯合雌蝇与特定的纯合GAL4驱动雄蝇杂交。对F1代进行热激处理。根据报告基因中FRT-stop-FRT表达盒被随机切除的数量，可产生七种不同的荧光颜色。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
水浴锅	Grant	GD100
PCR管	Sarstedt	72.737.002
镊子	Dumont	11251-20
解剖皿 30 mm x 12 mm	Electron Microscopy Sciences	70543-30	玻璃解剖皿
Pyrex 3孔玻璃点样板	Corning	7223-34	玻璃解剖板
Sylgard 黑色	SYLGARD, Sigma-Aldrich	805998	自制，含木炭
ExpressFive S2细胞培养基	Invitrogen	10486-025
20% PFA	Electron Microscopy Sciences	15713
Triton X-100	Roth	3051.3
正常山羊血清	Jackson Laboratories	005-000-121
正常驴血清	Jackson Laboratories	017-000-121
牛血清白蛋白	Sigma	A9647
兔源HA标签抗体	Cell Signaling	C29F4	一抗，稀释比例1:500
大鼠源FLAG标签抗体	Novus Biologicals	NBP1-06712	一抗，稀释比例1:100
小鼠源V5标签:DyLight 549	AdSerotec	411	标记抗体，稀释比例1:200
抗兔AlexaFluor 488	Invitrogen	A11034	二抗，稀释比例1:250
抗大鼠DyLight 647	Jackson Laboratories	712-605-153	二抗，稀释比例1:100
Vecta Shield	Vector Laboratories	H-1000
SlowFate Gold	Invitrogen	S36937
Secure Seal间隔垫片	Grace Biolabs		联系公司订购
显微镜盖玻片 22 × 60 mm	Marienfeld	101152
显微镜盖玻片 22 × 22 mm	Roth	H874
立体显微镜，Leica MZ6	Leica
共聚焦激光扫描显微镜 LSM710	Zeiss
Immersol	Zeiss	518 F	荧光显微镜用浸油，无卤素
Immersol	Zeiss	W 2010	水浸物镜用浸液，无卤素
R56F03-GAL4 (EG)	Bloomington Stock Center	39157	GAL4驱动系
R86E01-GAL4 (ALG)	Bloomington Stock Center	45914	GAL4驱动系
hspFlpPestOpt; UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5	Bloomington Stock Center	64085	UAS报告基因系（https://bdscweb.webtest.iu.edu/stock/misc/mcfo.php）
Multi Time Macro	Zeiss		自动扫描软件