一种立体定向引导的听觉皮层损毁技术用于大鼠听觉皮层切除

摘要

来源：Lamas, V.，等。大鼠听觉皮层的立体定向消融及脑内病灶定位。J. Vis. Exp. (2017)。

本视频演示了一种在大鼠中进行的立体定向引导手术，用于损毁听觉皮层。步骤包括：将麻醉后的大鼠固定于立体定向仪中，识别解剖学标志；在听觉皮层上方的颅骨处开窗；吸除皮层各层组织；并提供术后护理，以评估损毁对声音处理功能的影响。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 大鼠的准备

注意：我们使用雄性大鼠进行实验，以避免任何激素变化的影响。

1. 通过肌肉注射氯胺酮盐酸盐（30 mg/kg）和赛拉嗪盐酸盐（5 mg/kg）的混合物对动物进行麻醉；此剂量下，大鼠应处于深度麻醉状态约1小时。
2. 轻捏大鼠脚趾；若无回缩反射，则表明动物已完全失去意识。若大鼠对刺激有反应，应追加初始剂量三分之一的麻醉剂。
3. 剃除头皮毛发，并用聚维酮碘对术区进行消毒。
4. 将动物置于加热垫上以维持体温在38 °C，并使用两个耳杆和一个咬合杆将动物头部固定于立体定位仪中。操作时需小心，避免耳杆刺破鼓膜。
5. 通过在每只眼睛上滴加一滴眼用凝胶或生理盐水来保护角膜。

2. 大鼠颞骨中交流电位置

1. 使用手术刀沿中线切开，暴露颅骨，并剥离覆盖颅骨表面的骨膜。
2. 用无菌棉签轻轻擦去覆盖颅骨表面的血液，根据 Paxinos 和 Watson 大鼠脑图谱确定前囟（bregma）、后囟（lambda）和耳间0点（interaural 0）的位置。
3. 用手术刀在颞肌靠近其颅骨背侧附着处做一切口。用针线将肌肉拉出，并将缝线固定在立体定位仪框架上，以暴露颞骨。若出现出血，用冷的无菌生理盐水冲洗。
4. 将一根无菌直针安装至立体定位微量操作器中，确保其完全固定。
5. 缓慢降低针头，使其刚好位于颅骨表面正上方，将针尖定位至耳间0点。将此位置设为零点，并从此点确定其他坐标。
6. 根据感兴趣脑区的不同，调整立体定位坐标。通过参考 Paxinos 和 Watson 大鼠脑图谱确定相应坐标。确定坐标后，移动针头至对应位置。
7. 利用以下四个点的坐标定位前连合（AC）：A：前后向（A/P）= -5.8 mm，内外侧向（M/L）= ±6.4 mm；B：A/P = -2.7 mm，M/L = ±6.4 mm；C：A/P = -2.7 mm，M/L = ±8.67 mm；D：A/P = -5.8 mm，M/L = ±8.67 mm。将针头缓慢下降至颞骨上方，依次观察这四个点。使用记号笔在颞骨上标记这些点，并按顺序连接成一个矩形；该矩形将作为骨窗开窗的参考指引（图1）。

3. 肩锁关节的外科暴露

1. 使用电动钻和小钻头（0.6 mm Ø）开窗。以8,000 rpm的速度沿矩形边缘钻孔，直至骨质破裂。通过滴加冷的无菌生理盐水冷却钻孔表面，以防止对皮质下结构造成损伤。当骨质破裂时，可感觉到阻力下降。注意避免钻入脑组织。
2. 当边缘松动后，用精细镊子提起覆盖的骨片，并将其保存在冷的无菌生理盐水中。

4. 消融AC

1. 使用手术显微镜（10倍放大），用显微外科刀片轻柔地切开脑膜，并用两把尖头镊子将其移除。若发生出血，用冷的无菌生理盐水冲洗。
2. 使用连接无菌20 G钝头针头的手术吸引装置（压力-0.24 bar）轻柔地吸除大脑皮层。此步骤至关重要，必须极为小心：仅吸除六层皮质结构，避免损伤下方的白质。
3. 持续吸引直至穿支动脉停止出血。
4. 完成吸引后，将取出的颅骨覆盖于损伤区域，并覆盖可吸收止血纱布。
5. 使颞肌恢复至原始位置，随后使用伤口夹（9 mm）缝合皮肤。涂抹抗生素软膏，并在术后三天内每日两次持续涂抹。
   注意：每次涂抹应为薄层，均匀覆盖伤口。
6. 术后1小时，在大鼠背部皮下注射布托啡诺（0.05 mg/kg）作为镇痛剂，之后每8小时注射一次，持续72小时。
7. 将动物留在加热垫上直至苏醒，然后将其放回饲养笼中恢复。

结果

图1：大鼠颞骨在三个不同手术步骤中的图像。（A）将前连合（AC）的立体定位坐标转移至颞骨。四个点的坐标分别为：A：前后（A/P）= -5.8 mm，内外（M/L）= ±6.4 mm；B：前后（A/P）= -2.7 mm，内外（M/L）= ±6.4 mm；C：前后（A/P）= -2.7 mm，内外（M/L）= ±8.67 mm；D：前后（A/P）= -5.8 mm，内外（M/L）= ±8.67 mm。（B）以上述坐标为参考，在颞骨表面绘制一个矩形，用于指导开窗位置。（C）钻骨后暴露的骨窗。可见脑表面的软脑膜及血管。R：吻侧，D：背侧。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
立体定位仪	David Kopf Ins.	900
手术显微镜	WILD M650 Heerbrugg
加热垫	DAGA
牙科微电机	W&H elco	5118
金刚砂钻头	B Braun	GD021R	0.6 mm
外科吸引装置	Atmos	Atmoforte E2
氯胺酮	Merial		30 mg/kg
赛拉嗪	Bayer		5 mg/kg
显微操作器	Narishige	SM-11
手术刀	Lawton
聚维酮碘	Meda	Betadine
无菌生理盐水	B.Braun
20G 无菌针头	Terumo Neolus
棉签
缝合材料	B.Braun
抗生素软膏	Quadriderm (Betametasona, Gentamicina, Clotrimazol) - Schering-Plough
镊子	dimeda	10.331.12
手术缝合针	World Precision Instruments	501940
丁丙诺啡	Indivior UK	Buprex	0.01-0.05 mg/kg
剪刀	dimeda	08.120.15
显微外科刀	MSP	7503
可吸收止血纱布	Surgicel
伤口夹	Reflex 9		9 mm