离心辅助的线粒体转移至胶质母细胞瘤干细胞

摘要

来源：Mombo, B. N.，等。MitoCeption：将分离的人MSC线粒体转移至胶质母细胞瘤干细胞。J. Vis. Exp. (2017)

在本视频中，演示了一种通过离心法将荧光标记的线粒体转入胶质母细胞瘤干细胞（GSCs）的方法。通过共聚焦显微镜检测荧光信号，确认供体线粒体被成功摄取并实现功能性整合。

方案

第1天

1. 间充质干细胞（MSC）线粒体的标记

1. 在线粒体制备前两天，将人源MSCs以4 × 10⁵个细胞的数量接种于100 mm培养皿中，加入10 ml含10%胎牛血清（FBS）的Eagle最低必需培养基（MEM），使第1天培养时细胞密度达到所需水平。
2. 用4 ml PBS洗涤MSCs，随后加入4 ml预热至37 °C的含1% FBS的αMEM培养基。
3. 加入适量的线粒体活体染料，将细胞置于37 °C培养箱中孵育30分钟。
4. 移除线粒体染料溶液，用4 ml预热至37 °C的含1% FBS的αMEM培养基洗涤细胞两次，再加入4 ml含10% FBS的αMEM培养基，于37 °C继续培养细胞。
5. 在染料处理30分钟后更换培养基（10 ml含10% FBS的αMEM），并在2小时后再次更换一次。

第1天

2. 胶质母细胞瘤干细胞（GSC）的标记

1. 将生长于聚HEMA包被的细胞培养瓶中、呈神经球形态的GSCs Gb4细胞系（10 × 10⁶ 个细胞）进行解离
2. 将GSCs以每孔10⁵ 个细胞的密度接种于48孔板中，每孔加入500 µl GSC增殖培养基（见表1）
3. 在20 °C下以270 × g离心5分钟
4. 加入适量细胞活体染料，并在37 °C下孵育30分钟
5. 向48孔板每孔加入500 µl GSC基础培养基（表1）
6. 在20 °C下以270 × g离心5分钟，吸除上清液
7. 重复步骤2.5至2.6
8. 每孔加入500 µl GSC基础培养基，并在37 °C下孵育30分钟
9. 在20 °C下以270 × g离心5分钟，吸除上清液
10. 向48孔板每孔加入500 µl GSC增殖培养基，并置于37 °C培养箱中孵育
    注意： 所示GSCs数量（10 × 10⁶ 个细胞）可满足不同剂量反应实验及FACS对照实验的需要。一旦实验条件进一步明确，该细胞用量可相应减少

3. 胶质母细胞瘤干细胞的接种

1. 在50 ml离心管中，以270 × g、20 °C离心5分钟，收集GSC（胶质母细胞瘤干细胞）神经球（10 × 10⁶个细胞）。
2. 用5 ml HBSS（Hanks平衡盐溶液）洗涤细胞，并在20 °C下以270 × g离心5分钟。
3. 吸除上清液。
4. 将GSC沉淀物轻轻重悬于100 µl胰蛋白酶-EDTA（乙二胺四乙酸）（0.25%）中（每10 × 10⁶个细胞）。
5. 在37 °C孵育3分钟。
6. 加入10 µl CaCl₂（20 mM）和2 µl DNase I（10 mg/ml）。
7. 使用P200移液器轻轻吹打30–50次，使神经球解离。避免产生气泡。在显微镜下检查，确认所有GSC均已解离。
8. 加入10 µl胰蛋白酶抑制剂（5%）和10 ml HBSS。
9. 在20 °C下以270 × g离心GSC 7分钟。
10. 弃去上清液，加入10 ml GSC基础培养基。
11. 使用Thoma计数板对GSC进行计数，然后在20 °C下以270 × g离心7分钟。
12. 加入适量GSC增殖培养基，使细胞浓度达到10⁶个GSC/ml。
13. 每孔加入100 µl细胞悬液（含10⁵个GSC），接种至96孔板中。
14. 将96孔板在20 °C下以270 × g离心7分钟，使GSC沉降至孔底。
15. 将96孔板在37 °C孵育。

第2天

4. 间充质干细胞（MSC）线粒体分离

1. 将微量离心管离心机的温度调节至 4 °C。
2. 准备两个含有线粒体提取试剂的 1.5 ml 离心管，分别标记为“A”和“C”（其中分别加入 200 µl 试剂 A 和 400 µl 试剂 C，均含有不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂）。另准备两个标记为“MSC”和“Mito”的离心管。所有离心管均置于冰上。同时准备用于线粒体系列稀释的离心管。
3. 用 10 ml 预热至 37 °C 的 PBS（磷酸盐缓冲盐水）洗涤间充质干细胞（MSCs）。
4. 用 2 ml 不含 EDTA 的胰蛋白酶洗涤 MSCs 10 秒，然后加入 1 ml 不含 EDTA 的胰蛋白酶。于 37 °C 孵育细胞 5–10 分钟。
5. 加入 10 ml 含 10% 胎牛血清（FBS）的 αMEM 培养基终止消化，收集 MSCs，并转移至 50 ml 离心管中。
6. 在 20 °C 下以 270 × g 离心 5 分钟。
7. 弃去上清液，并向细胞沉淀中加入 10 ml 含 10% FBS 的 αMEM 培养基。
8. 使用 Malassez 血细胞计数板对 MSCs 进行计数。
9. 取 4–5 × 10⁵ 个 MSCs，在 20 °C 下以 270 × g 离心 5 分钟。
10. 弃去上清液，向细胞沉淀中加入 1 ml 冰冷的含 10% FBS 的 αMEM 培养基，并将细胞转移至标记为“MSC”的离心管中。将该管置于冰上保存。
11. 将含有 MSCs 的离心管在 4 °C 下以 900 × g 离心 5 分钟。
12. 彻底移除管内残留的培养基。
13. 加入 200 µl 线粒体分离试剂 A（含不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂）。以中等速度涡旋振荡 5 秒，然后将离心管准确置于冰上静置 2 分钟。
14. 加入 2.5 µl 线粒体分离试剂 B。以最大速度涡旋振荡 10 秒，随后将离心管放回冰上。每间隔 30 秒重复一次，共重复 5 分钟。
15. 加入 200 µl 线粒体分离试剂 C（含不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂）。通过轻轻倾斜倒置离心管的方式混匀（约 30 次，切勿涡旋振荡）。在 4 °C 下以 700 × g 离心 10 分钟。
16. 将上清液（含 MSC 线粒体）转移至标记为“Mito”的离心管中。
17. 在 4 °C 下以 3,000 × g 离心 15 分钟，以获得线粒体沉淀。弃去上清液。沉淀即为分离得到的线粒体。
18. 用 200 µl 试剂 C 冲洗线粒体沉淀。然后在 4 °C 下以 12,000 × g 离心 5 分钟，再次收集线粒体沉淀。

5. 分离的MSC线粒体向GSC的转移（MitoCeption）

1. 向从间充质干细胞（MSCs）分离的线粒体沉淀物（4 × 10⁵）中加入 200 µl 预冷（0 °C）的 GSC 增殖培养基。
2. 将线粒体制备物（置于 GSC 增殖培养基中）稀释，以确保向 GSCs 中恒定加入 20 µl 线粒体悬液。
3. 将分离的线粒体按所需浓度（0.1 至 10 µg）加入含有 GSCs 的 96 孔板孔中。加样时应缓慢靠近孔底，至少完整覆盖整个孔底表面一次。
4. 将含有接受线粒体的 GSCs 及对照组的 96 孔板在 4 °C 条件下以 1,500 × g 离心 15 分钟。
5. 离心后立即将培养板放入 37 °C 细胞培养箱中。
   注意：线粒体转移方案依赖于在适当的离心力下，将线粒体悬液离心至培养细胞上，离心次数可根据线粒体供体/受体细胞体系进行调整。

表1：培养基。

细胞培养基	成分
GSC 基础培养基	DMEM/F-12 添加以下成分：
	胰岛素 20 mg/ml
	N2 添加剂 1x
	葡萄糖 3 g/L
	L-谷氨酰胺 2 mM
GSC 增殖培养基	在基础培养基中添加：
	B27 添加剂 1x
	EGF 10 ng/ml
	bFGF 10 ng/ml
	Fungine 10 mg/ml
	Fungizone 0.25 mg/ml
	肝素 2 mg/ml
	环丙沙星 2 μg/ml
	庆大霉素 2 μg/ml
MSC 增殖培养基	αMEM 添加以下成分：
	L-谷氨酰胺 2 mM
	10% FBS
	bFGF 2 ng/ml

结果

图1：通过MitoCeption技术将分离的MSC线粒体转移至GSC的实验流程。 图中展示了MSC线粒体向GSC进行MitoCeption的7个步骤以及后续的GSC分析。各步骤编号与实验方案部分中的编号相对应。若未进行MSC和GSC的标记（如在功能分析中），则可省略步骤1和2，并从第2天开始执行本实验方案。相差显微图像显示了Gb4 GSC在第1天形成的神经球、第2天准备接受MSC线粒体转移的单细胞培养状态，以及线粒体转移后24小时（第3天）的状态。比例尺 = 100 µm。在步骤4中，展示了从MSC中分离前经MitoTracker Red CMXRos预标记的MSC线粒体的代表性显微照片。比例尺 = 5 µm。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
组织线粒体分离试剂盒	Fisher Scientific	10579663
N-2 添加剂（100倍浓缩）	Fisher Scientific	11520536
不含维生素A的B-27 添加剂（50倍浓缩）	Fisher Scientific	11500446
不含Ca²⁺和Mg²⁺的HBSS	Sigma	H4385
Poly Heme	Sigma	P3932
不含谷氨酰胺的aMEM	Ozyme	BE12-169F
不含谷氨酰胺的DMEM/F-12	Fisher Scientific	11540566
L-谷氨酰胺	Invitrogen	25030-024
葡萄糖	Sigma	G7021
胰岛素	Sigma	I 1882
人bFGF	R&D Systems	233-FB-025
人EGF	Peprotech	AF-100-15
肝素	Sigma	H3149
CaCl₂	MERCK	2382
胰蛋白酶抑制剂	Sigma	T9003
DNase I	SIGMA	10104159001
0.25%胰蛋白酶/1 mM EDTA	Invitrogen	25200056
胰蛋白酶	Gibco	15090-046
不含EDTA的蛋白酶抑制剂	Sigma	4693159001
环丙沙星	Sigma	17850-5G-F
两性霉素B	Invivogen	ant-fn-1
两性霉素B（Fungizone）	Thermofisher	15290018
庆大霉素	Euromedex	EU0410
MitoTracker Green FM	Molecular Probes	M7514
MitoTracker Red CMXRos	Molecular Probes	M7512
MitoTracker Deep Red FM	Molecular Probes	M22426
CellTracker Green CMFDA	Molecular Probes	C7025
CellTracker Blue CMF2HC	Molecular Probes	C12881
RIPA裂解液	Santa Cruz	sc-24948
FluoroDish 无菌培养皿	World Precision Instruments	FD35-100
血细胞计数板	Fisher Scientific	267110
FACS管	Beckman Coulter	25,23,749
FACS仪器	Gallios	3L 10C
LC FAST START DNA MASTER PLUS	Roche	3515885001