离心辅助的线粒体转移至胶质母细胞瘤干细胞

摘要

来源：Mombo, B. N.，等。MitoCeption：将分离的人MSC线粒体转移至胶质母细胞瘤干细胞。J. Vis. Exp. (2017)

在本视频中，演示了一种通过离心法将荧光标记的线粒体转入胶质母细胞瘤干细胞（GSCs）的方法。通过共聚焦显微镜检测荧光信号，确认供体线粒体被成功摄取并实现功能性整合。

方案

第1天

1. 间充质干细胞（MSC）线粒体的标记

1. 在线粒体制备前两天，将人源MSCs以4 × 10⁵个细胞的数量接种于100 mm培养皿中，加入10 ml含10%胎牛血清（FBS）的Eagle最低必需培养基（MEM），使第1天培养时细胞密度达到所需水平。
2. 用4 ml PBS洗涤MSCs，随后加入4 ml预热至37 °C的含1% FBS的αMEM培养基。
3. 加入适量的线粒体活体染料，将细胞置于37 °C培养箱中孵育30分钟。
4. 移除线粒体染料溶液，用4 ml预热至37 °C的含1% FBS的αMEM培养基洗涤细胞两次，再加入4 ml含10% FBS的αMEM培养基，于37 °C继续培养细胞。
5. 在染料处理30分钟后更换培养基（10 ml含10% FBS的αMEM），并在2小时后再次更换一次。

第1天

2. 胶质母细胞瘤干细胞（GSC）的标记

1. 将生长于聚HEMA包被的细胞培养瓶中、呈神经球形态的GSCs Gb4细胞系（10 × 10⁶ 个细胞）进行解离

结果

图1：通过MitoCeption技术将分离的MSC线粒体转移至GSC的实验流程。 图中展示了MSC线粒体向GSC进行MitoCeption的7个步骤以及后续的GSC分析。各步骤编号与实验方案部分中的编号相对应。若未进行MSC和GSC的标记（如在功能分析中），则可省略步骤1和2，并从第2天开始执行本实验方案。相差显微图像显示了Gb4 GSC在第1天形成的神经球、第2天准备接受MSC线粒体转移的单细胞培养状态，以及线粒体转移后24小时（第3天）的状态。比例尺 = 100 µm。在步骤4中，展示了从MSC中分离前经MitoTracker Red CMXRos预标记的MSC线粒体的代表性显微照片。比例尺 = 5 µm。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
组织线粒体分离试剂盒	Fisher Scientific	10579663
N-2 添加剂（100倍浓缩）	Fisher Scientific	11520536
不含维生素A的B-27 添加剂（50倍浓缩）	Fisher Scientific	11500446
不含Ca²⁺和Mg²⁺的HBSS	Sigma	H4385
Poly Heme	Sigma	P3932
不含谷氨酰胺的aMEM	Ozyme	BE12-169F
不含谷氨酰胺的DMEM/F-12	Fisher Scientific	11540566
L-谷氨酰胺	Invitrogen	25030-024
葡萄糖	Sigma	G7021
胰岛素	Sigma	I 1882
人bFGF	R&D Systems	233-FB-025
人EGF	Peprotech	AF-100-15
肝素	Sigma	H3149
CaCl₂	MERCK	2382
胰蛋白酶抑制剂	Sigma	T9003
DNase I	SIGMA	10104159001
0.25%胰蛋白酶/1 mM EDTA	Invitrogen	25200056
胰蛋白酶	Gibco	15090-046
不含EDTA的蛋白酶抑制剂	Sigma	4693159001
环丙沙星	Sigma	17850-5G-F
两性霉素B	Invivogen	ant-fn-1
两性霉素B（Fungizone）	Thermofisher	15290018
庆大霉素	Euromedex	EU0410
MitoTracker Green FM	Molecular Probes	M7514
MitoTracker Red CMXRos	Molecular Probes	M7512
MitoTracker Deep Red FM	Molecular Probes	M22426
CellTracker Green CMFDA	Molecular Probes	C7025
CellTracker Blue CMF2HC	Molecular Probes	C12881
RIPA裂解液	Santa Cruz	sc-24948
FluoroDish 无菌培养皿	World Precision Instruments	FD35-100
血细胞计数板	Fisher Scientific	267110
FACS管	Beckman Coulter	25,23,749
FACS仪器	Gallios	3L 10C
LC FAST START DNA MASTER PLUS	Roche	3515885001