在不同硬度水凝胶上培养的神经嵴细胞的荧光染色

摘要

来源： Le, T. P., 等，一种优化的 O9-1/水凝胶系统用于研究神经嵴细胞中的机械信号。J. Vis. Exp. (2021)

在本视频中，我们介绍使用荧光显微镜进行荧光染色的实验步骤，以展示在不同硬度水凝胶上培养的神经嵴细胞经鬼笔环肽染色后，细胞骨架结构的可视化与分析方法。

方案

1. 通过免疫荧光染色对刚度进行分子分析

1. 使用镊子将盖玻片转移至新的培养板，以减少细胞直接在培养板上生长带来的假阳性信号。用 500 µL 无菌 PBS 洗涤细胞 3 次，以去除死细胞及残留的培养基。
2. 在室温下用 500 µL 未扰动的 4% 多聚甲醛（PFA）固定细胞 10 分钟。随后，每次用 500 µL PBS/孔洗涤细胞，共洗涤 3 次，每次 2 分钟。
   注意：如需暂停实验流程，可将样品在 4 °C 下保存。
3. 在室温下用 500 µL 0.1% Triton X-100 处理细胞 15 分钟。然后，用 500 µL PBS/孔洗涤细胞 3 次。
4. 每孔加入 250 µL 含 10% 驴血清（用 PBS 和 0.1% Tween 20 稀释）的封闭液，在室温下封闭细胞 30 分钟。
5. 将鬼笔环肽（用于 F-actin 染色）按 1:400 的比例稀释于 250 µL 含 10% 驴血清的溶液中，与细胞在室温下孵育 30 分钟。随后，用 PBS 洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟。
   注意：568 nm 鬼笔环肽可与 488 nm 或 647 nm 二抗共同孵育，也可单独使用。
6. 将 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，1:1000 稀释）加入 250 µL PBS 中，与细胞在室温下孵育 10 分钟，之后再用 PBS 洗涤一次，持续 2 分钟。
7. 每孔加入 3–4 滴封片剂。将样品在 4 °C 下保存至少 2 小时，以确保封片剂充分固化，再进行成像。
8. 使用荧光显微镜对每种水凝胶样品至少拍摄 3 个随机视野的图像，获取各通道的独立图像及合并图像。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2 mm #1 Corning 0211 玻璃盖玻片	Chemglass Life Sciences	CLS-1763-012
25 mm #1 Corning 0211 玻璃盖玻片	Chemglass Life Sciences	CLS-1763-025
4孔细胞培养板	Thermo Scientific	179830
4% 多聚甲醛	Sigma Aldrich	J61899-AP
40% 丙烯酰胺	Sigma Aldrich	A4058
Alexa Fluor 488 鬼笔环肽	Thermo Fisher	A12379
Ⅰ型胶原蛋白（100 mg）	Corning	354236
DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚，二盐酸盐）	Thermo Fisher	D1306
驴血清	Sigma Aldrich	D9663
无菌 1× PBS	Hyclone	SH30256.02
荧光显微镜	Leica