利用化学交联实验在小鼠脑组织中交联神经元表面蛋白

摘要

来源：Sumitomo, A.，等。BS3化学交联实验：评估慢性应激对啮齿类动物脑内细胞表面GABAA受体表达的影响。J. Vis. Exp. (2023)

本视频演示了使用双琥珀酰亚胺基辛二酸酯（Bis-sulfosuccinimidyl suberate，BS3）对神经元表面蛋白进行交联的方法。将分离并冷却的小鼠脑组织进行冠状切片，从切片中取出目标脑区，剪碎后用BS3处理。BS3可交联GABA受体等细胞表面蛋白，而细胞内蛋白则保持不变。在对样品进行后续分析前，使用甘氨酸终止反应。

方案

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 工作溶液和缓冲液的制备

注意：在检测当天早晨，准备以下溶液。此计算基于处理12只小鼠的两个脑区（即前额叶皮层 [PFC] 和海马 [HPC]）所需的溶液量。

1. 按表1所述配制人工脑脊液（aCSF，pH = 7.4）。将750 µL aCSF分装至每个取样管中，并将其置于冰上的金属温控块中预冷缓冲液。
2. 按表2所述配制裂解缓冲液。置于冰上保存（每份样品使用400 µL）。
3. 在5 mM柠檬酸钠缓冲液（pH = 5.0）中配制52 mM的双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯（BS3）储备液（26倍浓度）。
   1. 首先，配制100 mM柠檬酸（储备液A）和100 mM柠檬酸钠（储备液B）。
   2. 将储备液A和储备液B按1:20的比例用去离子水稀释。分别取100 µL加入1.9 mL水中，配制5 mM柠檬酸（储备液C）和5 mM柠檬酸钠（储备液D）。
   3. 取410 µL储备液C与590 µL储备液D混合，配制5 mM柠檬酸钠缓冲液（pH = 5.0）（溶液E，共1 mL）。
   4. 使用pH指示试纸确认溶液E的pH值。
   5. 将24 mg BS3溶于806.4 µL溶液E中，涡旋振荡30秒，配制BS3储备液（26倍浓度）。
   6. 另配制1 mL溶液E，作为非交联样品的溶剂对照。
      ​注意：建议在所有准备工作完成、实验即将开始时再配制BS3储备液。BS3应在4 °C干燥保存直至使用。一旦重悬，BS3的活性仅能维持约≤3小时。由于5 mM柠檬酸钠缓冲液（溶液E）的pH值会随时间升高，导致BS3加速水解，因此建议每次均从储备液A和B新鲜配制溶液E。由于BS3在低温下溶解度有限，重悬后的BS3应置于室温保存。重悬后的BS3需在3小时内使用完毕，不得冻融或重复使用。

2. 脑组织的解剖

注意：从这一步开始，至少需要两人协同操作。一人专注于动物解剖时，另一人应担任计时员，并协助协调实验流程。

1. 将第一只用于解剖的动物从饲养区转移至解剖室。
   注意：由于急性应激因素（例如新环境、血液气味）可能影响脑内蛋白质动态，动物应保留在远离解剖区域的原笼具中，并逐只带入解剖室立即进行断头处理。
2. 通过颈椎脱位后断头处死小鼠。迅速取出脑组织，并将其浸入盛有冰冻磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿中，持续10–15秒（图1）。
   注意：在进行BS3实验时，动物不使用麻醉，因为任何麻醉剂都可能影响神经递质受体在细胞表面的表达水平。
3. 将冷却后的脑组织置于冰上的脑切片模具中，使脑腹面朝上（图2）。
4. 将第一把剃刀刀片插入嗅球与嗅束交界处，进行冠状面切割（图3）。使用另外三到四把剃刀刀片，以1 mm间隔连续对脑前部进行冠状面切片。
5. 同时握住所有已插入的剃刀刀片，将冠状切片从脑切片模具上整体抬起，将脑后部留在模具内。用镊子将各刀片分开，并将带有脑切片的一面朝上放置于平坦且冷却的表面上（图4）。
6. 识别包含目标区域的切片。若取材前额叶皮层（PFC），应选择包含嗅束的第一张切片之后的第二和第三张切片。
7. 使用组织打孔器切取目标区域，将其放置在冷却的剃刀刀片上，并将组织均等地分为两份（例如，分别来自左右半球的组织；若目标蛋白在两侧半球表达水平相当，则其中一半用于BS3交联反应，另一半作为无交联对照）。
8. 在剃刀刀片上用镊子尖端以多次垂直动作将每份组织剪碎成小块，避免压碎或研磨组织。此操作可最大化BS3可接触的表面积，同时尽量维持细胞膜完整性。剪碎后应立即转移至相应离心管中（见步骤3.3）。

3. 交联反应

1. 当上一只小鼠的脑组织解剖即将完成时（步骤 2.10），将下一只待解剖的动物从饲养区转移至解剖室。
2. 在剪碎的组织即将转移至相应离心管前，立即向预先在冰上预冷的离心管中加入 30 µL BS3 溶液（26 倍浓度）或对照溶液 E。每处理一个管需更换移液器吸头，以确保无 BS3 污染非交联对照管。
3. 将剪碎的组织（来自步骤 2.8）转移至相应的离心管中，随后开始解剖下一只动物（步骤 2.2）。
4. 颠倒并混匀离心管，使组织块进一步分散为更小的碎片，然后将样品置于冷室中的管式旋转仪上孵育 30 分钟至 2 小时。记录每管 BS3 孵育的起始时间。最佳孵育时间请参见讨论部分。
5. 通过向离心管中加入 78 µL 1 M 甘氨酸终止反应，并在 4 °C 下持续旋转孵育 10 分钟。记录每管淬灭反应的起始和结束时间。在此期间继续协助负责动物解剖的人员，包括运送下一只动物（步骤 3.1）以及协助完成交联步骤（步骤 3.2）。
   ​注意：所有样品的处理必须在完全相同的时间点进行。若解剖室与冷室距离较远，强烈建议安排第三位人员专门负责在冷室中进行样品孵育与淬灭操作。

表1：人工脑脊液的成分。

工作浓度	储备液	需加入的储备液体积
1.2 mM CaCl2	480 mM (400x)*	100 μL
20 mM HEPES	1 M (50x)	800 μL
147 mM NaCl	5 M (34x)	1176.5 μL
2.7 mM KCl	1.08 M (400x)	100 μL
1 mM MgCl2	400 mM (400x)	100 μL
10 mM 葡萄糖	2.5 M (250x)	160 μL
去离子水		37.563 mL
总计		40 mL
* CaCl2 储备液应在实验当天新鲜配制。

表2：裂解缓冲液的组成

工作浓度	储存液	需加入的储存液体积
25 mM HEPES	1 M (40x)	500 μL
500 mM NaCl	5 M (10x)	2 mL
2 mM EDTA	0.5 M (250x)	80 μL
1 mM DTT	1 M (1000x)	20 μL
0.1% NP-40	10% (100x)	200 μL
蛋白酶抑制剂混合物	100x	200 μL
去离子水		17 mL
总计		20 mL

结果

图1：从小鼠颅骨中完整取出并置于冰上磷酸盐缓冲液（PBS）中的全脑组织。 在将完整脑组织从颅骨中取出后，立即将其浸入冰上预冷的PBS中，持续10–15秒。此步骤可减缓脑组织的代谢活动，最大限度减少蛋白质的转运与降解，同时使组织变硬，从而便于后续的脑切片操作。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.5 M EDTA，pH 8.0	Invitrogen	15575020
1 M HEPES	Gibco	15630080
10x TBS	Bio-Rad	1706435
2.5 M（45%，w/v）葡萄糖	Sigma	G8769
2-巯基乙醇	Sigma	M3148
4x SDS 样品缓冲液（Laemmli）	Bio-Rad	1610747
双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯（BS3）	Pierce	A39266	免称量形式；10 × 2 mg
脑组织切片模具	Ted Pella	15003	适用于小鼠，30 g 成年，冠状面，1 mm
氯化钙（CaCl₂）	Sigma	C4901
弯头探针	Fine Science Tools	10088-15	大体解剖探针；45° 弯角
去离子水	milli-Q	EQ 7000	超纯水［电阻率 18.2 MΩ·cm @ 25 °C；总有机碳（TOC）≤ 5 ppb］
二硫苏糖醇（DTT）	Sigma	10197777001
滤纸（3MM）	Whatman	3030-917
镊子（大号）	Fine Science Tools	11152-10	超细 Graefe 镊
镊子（小号）	Fine Science Tools	11251-10	Dumont #5 镊子
甘氨酸	Sigma	W328707
氯化镁	Sigma	M2670
Nonidet-P40 替代物（NP-40）	SantaCruz	68412-54-4
氯化钾（KCl）	Sigma	P9541
剪刀（大号）	Fine Science Tools	14007-14	手术剪刀 — 带锯齿
剪刀（小号）	Fine Science Tools	14060-09	精细剪刀 — 锐利刃
氯化钠（NaCl）	Sigma	S9888
组织打孔器（内径 1 mm）	Ted Pella	15110-10	Miltex 活检打孔器带推杆，内径 1.0 mm，外径 1.27 mm
试管旋转仪（LabRoller）	Labnet	H5000