评估运动神经元中的葡萄糖摄取 果蝇 葡萄糖代谢上调的幼虫

摘要

来源：Loganathan, S.，等，在 TDP-43 蛋白病的 Drosophila 模型中测量葡萄糖摄取。J. Vis. Exp. (2021)。

该视频展示了一种利用基于荧光共振能量转移（FRET）的细胞内葡萄糖传感器，测量果蝇（Drosophila）幼虫运动神经元葡萄糖摄取的技术。在解剖幼虫以暴露腹神经索后，可通过传感器供体荧光团发出的荧光观察运动神经元。当葡萄糖刺激时，传感器的供体与受体荧光团之间发生FRET，触发受体荧光团发射荧光，从而实现对照组幼虫与葡萄糖代谢上调突变体幼虫之间葡萄糖摄取水平的比较。

方案

1. Drosophila 腹神经索（VNC）解剖

1. 制备硅胶弹性体解剖皿。
   1. 根据制造商说明书，将硅胶弹性体组分倒入50 mL离心管中，并充分搅拌。
   2. 用约2 mL弹性体混合物填充35 mm组织培养皿。使用注射器去除所有气泡。盖上培养皿，置于60 °C烘箱中过夜固化。
2. 解剖 Drosophila 幼虫以暴露腹神经索（VNC），同时维持组织活性。
   1. 取一条游走期三龄幼虫，用ddH₂O冲洗，然后将其置于铺有弹性体的培养皿中的一滴血淋巴样3号缓冲液（HL3缓冲液）（70 mM NaCl、5 mM KCl、20 mM MgCl₂、10 mM NaHCO₃、115 mM蔗糖、5 mM海藻糖、5 mM羟乙基哌嗪乙磺酸[HEPES]；pH 7.1）中。
   2. 在解剖显微镜下，使用一对镊子（#5或55号镊子）将幼虫的前端和后端背侧朝上固定，并用昆虫针（Minutein Pins）沿纵轴轻轻拉伸幼虫。
   3. 使用斜角虹膜剪，在后端固定针稍上方做一切口，然后从该切口开始，沿幼虫体长方向向前端做垂直切开。
   4. 必要时添加数滴HL-3缓冲液。在不干扰中枢神经系统（CNS）的前提下，移除气管及其他漂浮组织器官。将体壁瓣固定并展开，以暴露中枢神经系统，同时保持神经肌肉系统（VNCs、轴突及神经肌肉接头）完整。

2. 图像采集

1. 优化成像参数。
   1. 在开始解剖前，先打开显微镜和激光器。必须使用配备40倍水浸物镜的直立共聚焦显微镜进行图像采集。使用405 nm激光激发青色荧光蛋白（CFP），并在CFP（465–499 nm）和FRET（535–695 nm）检测通道中同时采集图像。
   2. 优化采集参数，包括扫描速度（6）、平均次数（2）、物镜（40×）、缩放倍数（1×）、针孔大小（1 AU）和空间分辨率（512 × 512）。调节增益，使信号处于最佳动态范围。所有基因型必须使用相同的参数。
2. 对腹神经索（VNC）内的运动神经元进行成像。
   1. 将盛有解剖样本的硅胶培养皿置于物镜下，降低物镜使其接触海藻糖-蔗糖HL3缓冲液。必须确保物镜完全浸没在缓冲液中，必要时可添加更多缓冲液。
   2. 使用CFP和FRET通道，手动选择一个光学切片，其中应至少包含6个沿腹神经索中线清晰聚焦的运动神经元。运动神经元的识别依据是葡萄糖传感器的表达及其在前后轴上的位置。
   3. 每10秒采集一次图像，持续10分钟。这些图像代表基线水平。
3. 用添加葡萄糖的HL-3缓冲液进行刺激。
   1. 使用巴斯德吸管移除含海藻糖和蔗糖的HL3缓冲液，并替换为添加5 mM葡萄糖的HL-3缓冲液（70 mM NaCl、5 mM KCl、20 mM MgCl₂、10 mM NaHCO₃、115 mM蔗糖、5 mM葡萄糖、5 mM HEPES，pH 7.1）。此步骤需格外小心，尽可能避免腹神经索移动。
   2. 继续每10秒采集一次图像，持续10分钟。这些图像代表刺激阶段。
4. 将图像保存为.czi文件，或任何成像软件支持的文件格式，文件名应包含日期、遗传背景、实验条件（基线或刺激）以及所用通道。
5. 重复使用相同参数对所有基因型进行成像（图1A）。

结果

图 1：在 TDP-43 突变背景下葡萄糖传感器的图像分析。（A）在基础状态和刺激条件下，葡萄糖传感器对照组和 TDP-43^G298S 样本中 FRET 与 CFP 信号的代表性图像。每幅图像中均标出一个代表性运动神经元，作为感兴趣区域（ROI）的示例。比例尺：20 µm。放大倍数：40×。（B）葡萄糖传感器和 TDP-43 突变型运动神经元在 20 分钟成像期间 FRET/CFP 的平均比值。比值已根据每种基因型的平均基础比值进行归一化处理（参见实验方案中的基础值归一化）。所示数值来自每种基因型 5 个腹神经索（VNC）中的 25–30 个运...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
35 mm 组织培养皿	Sigma Aldrich	CLS430165
40X 水浸物镜	Zeiss	440090	可浸入式，数值孔径 0.8
解剖剪刀	Roboz	RS-5618
Dumont #5 镊子	VWR	100189-236
Dumont #55 镊子	VWR	100189-244
Minutien 固定针	Fine Science Tools	26002-10	用于解剖
SYLGARD 184 硅胶弹性体试剂盒	Dow	1317318
Zeiss LSM880 NLO 直立式多光子/共聚焦显微镜	Zeiss	N/A