小鼠脑组织切片中荧光标记星形胶质细胞的免疫染色

摘要

来源：Eaker, A. R.，等。厚型游离组织切片中星形胶质细胞区域体积与拼接分析。J. Vis. Exp. (2022)

本视频演示了使用荧光标记的星形胶质细胞，通过一抗和二抗对固定的小鼠脑组织切片进行免疫染色，并通过共聚焦显微镜捕获染色后星形胶质细胞图像的实验流程。

方案

所有涉及动物样本的实验程序均已通过相应的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 免疫染色

注意：所有洗涤和孵育步骤均在转速约为 100 rpm 的轨道摇床上进行。除一抗孵育在 4 °C 下进行外，其余所有步骤均在室温下操作。提前配制封片剂：将各组分加入 50 mL 离心管中，在旋转混合仪上过夜混合。避光保存，4 °C 条件下可保存最多 2 个月。若内源性荧光信号已足够用于成像和分析，无需进行免疫染色，则可跳过步骤 1.1–1.9。若跳过免疫染色步骤，需用 TBS 洗涤三次，每次 10 分钟，然后继续执行步骤 1.10。

1. 通过将1 mL 10% Triton-X加入50 mL离心管中，并用1×TBS定容至50 mL，配制新鲜的TBST溶液（含0.2% Triton的TBS）。为每只小鼠脑组织准备2 mL封闭液和抗体溶液（含10%山羊血清的TBST）。
   注意： 为获得最佳结果，每次新的染色实验均应现配TBST，并使用高质量的10%水溶性Triton-X（参见材料表）。
2. 根据示意图（图1）标记一个24孔板。将不同样本置于不同行，不同溶液置于不同列。在前三个孔列（“洗涤1”、“洗涤2”和“洗涤3”）中各加入1 mL TBST。在第四列中加入1 mL封闭液。
3. 用本生灯将5.75号巴斯德吸管末端熔化成小钩状，制成玻璃挑针。使用该挑针将组织切片从12孔板转移至24孔板的“洗涤1”列中。
   注意： 为获得最佳结果，建议在开始染色前对切片进行筛选。筛选方法：将切片逐个转移至盛有1×TBS的培养皿中，使用荧光显微镜配合5倍或10倍物镜观察，确保切片中含有足够数量的荧光标记细胞。建议每孔染色4至6个切片，必要时可增至8个。
4. 将切片依次在“洗涤1”、“洗涤2”和“洗涤3”孔中各洗涤10分钟，随后在封闭液中于4 °C孵育1小时。使用玻璃挑针将切片从一个孔转移至下一个孔。该挑针可同时转移多个脑组织切片。
5. 为每个样本配制1 mL一抗溶液（例如，兔抗RFP 1:2000 或鸡抗GFP 1:2000）。将抗体加入抗体稀释液中，短暂涡旋混匀，然后在4 °C条件下以≥4,000 × g离心5分钟。将切片置于一抗溶液中，在4 °C摇床上孵育两至三个夜晚。
6. 一抗孵育结束后，吸除洗涤孔中的第一天TBST，向每个洗涤孔中加入1 mL新鲜TBST，并将切片转移至第一个洗涤孔中。重复洗涤三次，每次10分钟。
   注意： 吸液时可使用连接软管的9英寸巴斯德吸管，并连接至真空瓶。可使用实验室真空管线或电动真空泵作为真空源。
7. 在切片洗涤过程中，按1:200的比例将二抗加入抗体稀释液中，配制二抗溶液（例如，山羊抗兔594 或山羊抗鸡488）。短暂涡旋混匀后，在4 °C条件下以≥4,000 × g离心5分钟。
8. 将切片在二抗溶液中室温孵育3小时。此步骤及后续所有步骤均需避光，以防止二抗发生荧光淬灭。
9. 二抗孵育结束后，吸除第二天的TBST，向每个洗涤孔中加入1 mL新鲜TBST，并将切片转移至第一个洗涤孔中。在TBST中洗涤三次，每次10分钟。
10. 在最后一次洗涤期间，将封片剂从4 °C取出，使其升至室温。配制1×TBS与蒸馏水按2:1比例混合的溶液，并加入培养皿中。在载玻片表面加入800 µL 2:1 TBS:dH₂O混合液，准备封片。
    注意： 强烈推荐使用非固化型封片剂。固化型封片剂可能改变组织体积，从而干扰星形胶质细胞区域体积的准确分析。本方案在材料表中提供了一种简单且经济的自制封片剂配方。
11. 使用细毛刷将切片从“洗涤3”孔逐个转移至培养皿中。此步骤可去除Triton，并有助于切片展平。随后，将切片从培养皿转移至载玻片的液滴中。
12. 使用毛刷辅助调整切片位置，使其在载玻片上完全展平。用P1000移液器小心吸除载玻片上的多余液体，随后进行真空抽吸。
    注意： 可在巴斯德吸管末端连接P200移液器吸头，以实现更精细的真空抽吸控制。
13. 当载玻片上所有多余液体均被去除后，立即使用移液管向每个切片滴加一滴封片剂，并轻柔地盖上盖玻片。让封片剂自然扩散数分钟，然后通过真空抽吸去除从盖玻片边缘溢出的多余封片剂。
    注意： 在滴加封片剂前，切勿让切片干燥。若切片在封片前开始干燥，可能影响组织体积，进而干扰数据的准确采集。
14. 用透明指甲油密封盖玻片的四周边缘。室温下静置30分钟使载玻片干燥，然后平放于4 °C保存。成像前至少等待2小时，或于次日进行成像。
    ​注意： 使用抗GFP（绿色荧光蛋白）和RFP（红色荧光蛋白）抗体染色的切片，若已用指甲油完全密封，可在成像前保存长达两周。

结果

图1：星形胶质细胞结构域体积分析工作流程概览。 （A）本方案需要使用对星形胶质细胞具有稀疏或嵌合荧光标记的小鼠。（B）对小鼠进行灌注，随后切除脑组织并进行处理与冷冻。（C）使用冷冻切片机对冷冻脑组织进行切片，并（D）收集自由漂浮的组织切片。（E）切片完成后，通过免疫组织化学方法对漂浮切片进行染色，然后（F）将其贴附至载玻片上。（G）利用共聚焦显微镜对载玻片上的组织切片中的星形胶质细胞进行成像。（H<...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10x TBS（Tris缓冲盐水）			30 g Tris，80 g NaCl，2 g KCl，用HCl调至pH 7.4，加dH₂O定容至1 L；室温（RT）保存
12孔板	Genesee Scientific	25-106MP
1x TBS			100 mL 10x TBS + 900 mL dH₂O；室温保存
24孔板	Genesee Scientific	25-107MP
CD1小鼠	Charles River	22
共聚焦显微镜	Olympus	FV3000RS
盖玻片	Fisher Scientific	12544E
DAPI	Invitrogen	D1306
GFP抗体	Aves Labs	GFP1010
甘油	Thermo Scientific	158920010
山羊抗鸡IgG 488	Invitrogen	A-11039
山羊抗兔IgG 594	Invitrogen	A11037
山羊血清	Gibco	16210064
Imaris	Bitplane	N/A	版本 9.8.0
MATLAB	MathWorks	N/A
指甲油	VWR	100491-940
O.C.T. 包埋剂	Fisher Scientific	23-730-571
镜油	Olympus	IMMOIL-F30CC	与显微镜/物镜配套使用
手术剪刀 6"	Roboz	RS-6820
轨道摇床	Fisher Scientific	88861043	最低转速要求：25 rpm
画笔	Bogrinuo	N/A	来自Amazon，"细节画笔 - 微型画笔"
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	P6148
巴斯德吸管（5.75"）	VWR	14672-608
巴斯德吸管（9"）	VWR	14672-380
氯化钾	Sigma-Aldrich	P9541-500G
RFP抗体	Rockland	600-401-379
载玻片	VWR	48311-703
氯化钠	Fisher Scientific	BP358-212
氢氧化钠	Sigma-Aldrich	S5881
蔗糖	Sigma-Aldrich	S0389
移液管	VWR	414004-002
三溴乙醇	Sigma-Aldrich	T48402
三（羟甲基）氨基甲烷	Thermo Scientific	424570025
吐温X-100	Sigma-Aldrich	93443
吐温X-100（高纯度）	Fisher Scientific	50-489-120