激光捕获显微切割法从人死后小脑组织中分离浦肯野细胞

摘要

来源：Martuscello, R. T., L. 等，一种用于从人死后小脑中激光显微切割的浦肯野细胞中提取高质量RNA的不锈钢方案。 J. Vis. Exp. （2019）

本视频演示了如何使用激光显微切割技术从人死后小脑组织中分离浦肯野细胞。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 组织切片

1. 取一小块组织（约 1 cm × 1 cm）用于切片，将剩余组织放回干冰或 -80 °C 冰箱中保存。
   注意：确保所取组织中约 95% 为小脑皮层，即浦肯野细胞所在区域。
2. 在“持样头”（chuck）上放置约 3 mm 高的 OCT 包埋剂小堆。以缓慢的环形运动逐层叠加，直至形成一个小隆起。
3. 当 OCT 部分冻结但仍中心尚存液态时，将组织置于其上。切勿将组织深压入 OCT 中。让组织自然停留在表面，直至完全冻结，通常需要 1–2 分钟。
4. 将带有冻结 OCT 和组织的“持样头”安装至冷冻切片机的切片臂上。调整组织位置，使其与切片刀刃齐平。
5. 让组织在切片臂中静置 15–20 分钟，以适应新温度。
   注意：根据组织厚度不同，需一定时间进行温度平衡。应确保组织充分适应温度，以便获得清晰切片。可调节 OT 和 CT 以辅助组织温度平衡。
6. 缓慢将组织移近刀刃。当组织接触刀刃后，开始修片过程。修片厚度应设为 30 μm。
7. 修片 2–3 次，直至可见皮层结构层次。
8. 将防卷板置于冷冻切片机刀刃正上方，并进行对齐。
   注意：冷冻切片机内的光线会在刀刃与防卷板交界处形成一条银线，表明防卷板已准确位于刀刃边缘正上方。
9. 开始以 14 μm 厚度进行切片。切片成功时，组织片将在防卷板下方保持平整。
   注意：若组织粘连，需确保防卷板足够低温。必要时，可在防卷板外侧（不接触载物台的一侧）放置一小块干冰，以快速降温。
10. 连续切取 4–6 张切片，并在冷冻切片机载物台上水平排列。
11. 将载玻片倾斜，一次性拾取所有组织片。
    注意：使用毛刷轻轻抬起组织两端，使其更易于被载玻片整体拾取。切勿逐张拾取组织，因暴露于室温空气中会破坏 RNA 完整性。
    警告：切勿让膜接触冷冻切片机载物台。若膜接触载物台，将导致其从玻璃载玻片上脱落，进而影响后续激光显微切割（LCM）操作。
12. 立即进入第 6 步，切勿延迟固定步骤。

2. 组织固定/无染色可视化

1. 立即进入乙醇固定步骤
2. 将载玻片放入盛有70%乙醇的载玻片架中，冰上孵育2分钟。
3. 将载玻片放入盛有95%乙醇的载玻片架中，冰上孵育45秒。
4. 将载玻片放入盛有100%乙醇的载玻片架中，室温孵育2分钟。
5. 将载玻片在盛有二甲苯1的载玻片架中浸没3次，室温操作。
6. 将载玻片放入盛有二甲苯2的载玻片架中，室温孵育5分钟。
7. 在洁净环境中干燥至少30分钟。干燥时间更长（最长至60分钟）效果更佳。
   注意：干燥时应使用直立式载玻片架，并在通风橱中进行。二甲苯具有挥发性，若将载玻片平放，会导致二甲苯在组织切片上积聚，使组织过深染色。

3. 解冻保存的载玻片以供使用

1. 在计划使用前1小时，从-80 °C冰箱中取出装有单张切片的管子。
2. 不要立即打开管子。让管子逐渐升至室温。冷凝水仅会出现在管子外表面。
3. 当管子达到室温且所有冷凝水消失后（约30–40分钟），打开管盖，使切片暴露于室温空气中。
4. 让切片在室温下适应15–20分钟。然后将其留在已去盖的管内。
   注意：切片现已准备好进行LCM。

4. 浦肯野细胞的激光捕获显微切割：

注意：本实验方案部分仅讨论与捕获浦肯野细胞以进行后续RNA测序相关的具体步骤。本部分假设使用者已熟悉紫外激光显微切割仪及其配套软件的操作。

1. 使用RNase去污染剂清洁显微镜载物台和帽收集臂。
2. 戴手套操作，将载玻片放置于显微镜上，并将500 μL不透明帽放入收集臂中。
   注意：操作过程中始终通过使用RNase去污染剂清洁工作区域并在接触载玻片或不透明帽时戴手套，以确保正确的RNA操作技术。一旦载玻片和帽放置到位并开始激光显微切割，即可脱去手套。
3. 在低倍镜下，将不透明帽对准小脑组织，确保帽完全覆盖目镜中可见的整个区域。
   注意：仅显微镜的目镜可显示不透明帽是否居中，摄像头无法显示帽是否在组织上居中。根据激光显微切割显微镜的设计不同，通过不透明帽的视野可能仅在目镜中可见，或同时在目镜和摄像头中可见。
4. 使用5x–10x物镜观察小脑各层结构，并将光标置于分子层与颗粒细胞层交界处（即浦肯野细胞层）。
5. 切换至40X物镜，观察浦肯野细胞。
   注意：示例图像参见图1和图2。
6. 开始捕获浦肯野细胞。
   注意：进行RNA测序至少需要5 ng的RNA。大约1600–2000个浦肯野细胞可提供足够的RNA材料用于测序。RNA在显微镜下可保持稳定长达8小时。采集前应测试紫外光能量和紫外光焦距，以确保参数正确。随着时间推移，组织会持续干燥，可能需要调整紫外光能量和焦距。

结果

图1：经乙醇固定和脱水后，有无二甲苯处理的小脑分层及浦肯野细胞的可视化。 经乙醇固定和脱水后，有无二甲苯处理的代表性图像。分子层（ML）和颗粒细胞层（GCL）已标注。浦肯野细胞以箭头标示。（A）未使用二甲苯时小脑分层的5倍放大图像。比例尺：10 µm。（B）使用二甲苯时小脑分层的5倍放大图像。比例尺：10 µm。（C）未使用二甲苯时小脑分层的40倍放大图像。比例尺：1 µm。（D）使用二甲苯时小脑分层的40倍放大图像。比例尺：1 µm。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
MembraneSlide NF 1.0 PEN	Zeiss	415190-9081-000	适用于组织的膜片。我们不建议使用玻璃载玻片。
AdhesiveCap 500 Opaque	Zeiss	415190-9201-000	不透明盖帽仅用于增强倒置显微镜下的可视化效果
RNase Away	Molecular BioProducts	7005-11	其他RNase去污染产品也可使用。工作前用于清洁所有表面。
200 Proof Ethanol	Decon Laboratories	2701	若使用其他乙醇，需确保其高纯度。对组织固定至关重要。
Xylenes (Certified ACS)	Fisher Scientific	X5P-1GAL	若使用其他二甲苯，需确保其高纯度。对组织可视化至关重要。
UltraPure Distilled Water	Invitrogen	10977-015	其他无RNA/DNA/核酸酶的水也可使用。仅用于乙醇稀释。
Slide-Fix Slide Jars	Evergreen	240-5440-G8K	任何载玻片架或容器均可使用。使用前必须清洁。用于切片后固定。
Anti-Roll Plate, Assy. 70mm 100um	Leica Biosystems	14041933980	防卷板类型取决于冷冻切片机的型号及其在载物台上的安装位置。不同冷冻切片机要求各异。
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666A	Kimwipes可从任意供应商订购，尺寸不限。用于清洁显微镜和冷冻切片机。
Tissue-Plus O.C.T. Compound	Fisher Scientific	23-730-571	任何品牌的OCT均可接受。组织不会包埋于OCT中，仅用于将组织固定在“样品头”上。
Edge-Rite Low-Profile Microtome Blades	Thermo Scientific	4280L	刀片类型取决于冷冻切片机型号。不同冷冻切片机要求各异。
Leica Microsystems 3P 25 + 30MM CRYOSTAT CHUCKS	Fisher Scientific	NC0558768	样品头类型取决于冷冻切片机型号。不同冷冻切片机要求各异。任一尺寸均可使用。